NỘI DUNG
1. Thời gian và vị trí lấy máu

- Để tìm được ký sinh trùng sốt rét nhiều nhất phải lấy máu vào lúc bắt đầu lên cơn sốt hoặc đang lên cơn sốt. Tốt nhất nên lấy máu khi bệnh nhân chưa được điều trị. Nếu đã điều trị thì số lượng ký sinh trùng sốt rét sẽ giảm hẳn, khó phát hiện.
- Vị trí lấy máu: Thường lấy máu ở đầu ngón tay nhẫn trái hoặc ngón giữa. Có thể lấy máu ở dái tai. Đối với trẻ nhỏ, để tránh cho trẻ sợ hãi nên lấy máu ở ngón chân cái hoặc gót chân.

2. Phương pháp làm tiêu bản
- Làm tiêu bản máu đặc (giọt dày): Giọt đặc có ưu điểm là lấy nhiều máu nên tập trung nhiều ký sinh trùng.
- Làm tiêu bản máu đàn (giọt mỏng): Tiêu bản máu đàn do hồng cầu không bị phá vỡ nên hình thể ký sinh trùng đẹp và điển hình. Các thành phần hữu hình của máu đều đẹp và rõ ràng. Việc xác định thể loại ký sinh trùng trên giọt máu đàn là tốt nhất. Vì vậy trong chẩn đoán tìm ký sinh trùng sốt rét nên làm cả giọt đặc và giọt đàn.
- Làm tiêu bản kết hợp (giọt máu đặc và giọt máu đàn trên 1lam): Để tiện so sánh và bảo quản, thường làm 2 giọt máu đặc và máu đàn trên 1lam bằng cách dùng 1 lam kính sạch lấy 1 giọt máu có đường kính ≥ 1mm vào chính giữa lam kính để làm tiêu bản giọt đàn. Lấy 1 giọt máu khác có đường kính 1-2mm vào chính giữa phần lam còn lại để làm tiêu bản giọt đặc.

2.1. Chuẩn bị phương tiện

1.1. Dụng cụ
- Lam kính khô và sạch, lam kính có cạnh nhẵn để kéo máu giọt đàn.
- Kim chích máu vô khuẩn.
- Bông thấm nước vô khuẩn.
- Bút chì kính, phiếu xét nghiệm.
- Khay men.
- Ống đong các loại 10ml, 20ml.
- Pipet nhỏ giọt.
- Đũa thuỷ tinh.
- Giá nhuộm, giá cắm, các dụng cụ nhuộm.
- Đồng hồ.

1.2. Hoá chất
- Cồn 70[sup]0[/sup]
- Cồn tuyệt đối.
- Thuốc nhuộm giemsa mẹ.
- Dung dịch đệm hoặc nước cất.
- Giấy thử pH hoặc máy đo pH.
- Các dung dịch điều chỉnh pH : NaHPO4 2%, KH2PO4 2%.
- Cồn tuyệt đối.

Cách pha dung dịch đệm (phosphat buffer solution):
- KH2PO4: 0,7g
- NaHPO4: 1,0g
Cân 2 loại muối trên, mỗi loại vào 1 cốc chứa 150ml nước cất, dùng đũa thuỷ tinh khuấy đều cho tan hết. Đổ 2 loại vào ống đong rồi cho thêm nước cất cho đủ 1000ml. Khuấy đều, kiểm tra và điều chỉnh pH 7,2.

Cách pha dung dịch giemsa nhuộm:
Nhuộm thường quy: dung dịch giemsa 3- 4%: Pha 9,7 ml dung dịch đệm với 0,3ml giemsa mẹ, khi nhuộm để 30- 45 phút.
Nhuộm nhanh: Dung dịch giemsa 10%: Pha 9ml dung dịch đệm với 1ml giemsa mẹ. Khi nhuộm để 15- 20 phút.

2. Quy trình kỹ thuật:
- Sát khuẩn ngón tay chích máu bằng cồn 70[sup]0[/sup], chờ khô.
- Dùng kim vô khuẩn chích vào vị trí sát khuẩn, sâu vừa phải khoảng 1mm.
- Bỏ giọt máu đầu bằng cách dùng bông khô lau sạch.
- Vuốt ngón tay nhẹ nhàng từ trên xuống.
- Dùng 1 lam kính sạch cầm vào 2 cạnh mép lam áp nhẹ lên giọt máu để được 1 giọt có đường kính 3mm ở chính giữa lam hoặc 2 giọt ở 2 đầu lam.
- Dùng góc của 1 lam kính sạch khác đặt vào trung tâm của giọt máu đánh theo đường xoắn ốc từ trong ra ngoài khoảng 5- 6 vòng để được giọt máu có đường kính 0,9- 1,0cm.
- Lấy tiếp 1 lam kính sạch áp nhẹ lên giọt máu để được 1 giọt máu có đường kính khoảng 1mm ở vị trí 2/3 lam kính.
- Đặt cạnh của lam kéo lên phía trước sát với giọt máu tạo thành góc 30- 45[sup]0[/sup], lùi lam kéo về phía sau một chút để máu lan đều trên cạnh của lam kéo, đẩy nhanh lam kéo về phía trước, để khô tự nhiên.
- Sát khuẩn tay bệnh nhân.
- Đánh dấu tiêu bản máu, để khô
- Cố định tiêu bản giọt đàn bằng cách tay trái cầm tiêu bản nghiêng 30[sup]0[/sup], tay phải cầm pipet nhỏ 3- 4giọt cồn tuyệt đối lên phần đầu của tiêu bản máu. Dùng pipet gạt ngang cho cồn tràn phủ khắp diện tích máu, vừa gạt vừa nghiêng tiêu bản cho cồn chảy hết về đuôi của tiêu bản máu. Cắm tiêu bản lên giá cho khô.
- Đối với tiêu bản giọt đặc quá dày hoặc bị bẩn, mốc thì phải dung giải bằng cách nhỏ nước cất hoặc dung dịch giemsa 1% kín giọt máu, để 1- 2 phút, đổ nước đi rồi cắm lên giá cho khô.
- Xếp tiêu bản lên giá, nhỏ giọt dung dịch thuốc nhuộm phủ kín diện tích máu, để thời gian đúng với quy định.
- Rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy nhẹ, không đổ thuốc nhuộm trước, không để nước xối trực tiếp vào giọt máu, để tiêu bản khô tự nhiên.
- Soi kính hiển vi vật kính 100x, trả lời kết quả về ký sinh trùng sốt rét và nhận xét tiêu bản nhuộm.
- Ghi kết quả XN

nếu các bạn có điều kiện và thời gian để làm theo quy trình như trong giáo trình thì cực kỳ tốt.nhưng phần lớn khi làm trong bv thì tớ e khó lắm vì bn rất đông .ta chỉ cần pha DD Giemsa 10% với nước cất rùi nhuộm và chờ khoang 1nh 10m là ok.

Đã thử nhuộm thẳng bằng giemsa gốc chưa? Nhuộm 1 phút thôi! Xem có đẹp hơn giemsa 10% không?

Cho đến nay, phương pháp này vẫn được xem là phương pháp chẩn đoán ký sinh trùng sốt rét thuận tiện nhất vì cơ sở y tế nào cũng có thể trang bị được phương tiện, dụng cụ, trang thiết bị kỹ thuật; kể cả các trạm y tế xã, phường, thi trấn. Tuy nhiên, các xét nghiệm viên thực hiện công việc này phải cần chú ý để bảo đảm đúng kỹ thuật và thời gian yêu cầu lấy tiêu bản lam máu.

- Lam máu xét nghiệm phải được lấy trước khi cho bệnh nhân uống thuốc sốt rét vì thuốc có thể làm giảm mật độ ký sinh trùng sốt rét dưới ngưỡng phát hiện.

- Có thể lấy lam máu xét nghiệm bất cứ lúc nào nhưng lấy máu vào lúc bệnh nhân đang lên cơn sốt thì cơ hội có nhiều ký sinh trùng sốt rét xuất hiện mới dễ phát hiện.

- Nên thực hiện một giọt máu dày và một giọt máu mỏng trên cùng một lam kính. Giọt máu dày có nhiều ký sinh trùng sốt rét nên giúp cho việc chẩn đoán nhanh. Giọt máu mỏng giúp cho việc định loại ký sinh trùng sốt rét

hỉ nên kết luận lam máu âm tính khi đã xét nghiệm đủ 100 vi trường ở giọt máu dày mà không tìm thấy ký sinh trùng sốt rét. Khi đã tìm thấy một chủng loại ký sinh trùng sốt rét, vẫn phải tiếp tục tìm phát hiện xem có chủng loại ký sinh trùng sốt rét khác phối hợp không.

- Đối với chủng loại ký sinh trùng sốt rét Plasmodium vivax, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale có thể thấy tất cả các thể vô tính của ký sinh trùng ở máu ngoại vi. Đối với chủng loại ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum thường chỉ thấy thể tư dưỡng, thể giao bào; trường hợp bệnh rất nặng hoặc bị sốt rét ác tính mới có thể bắt gặp các thể khác.

-[u] Việc đánh giá mật độ ký sinh trùng sốt rét theo định tính được thực hiện đơn giản trên giọt máu dày với độ phóng đại của kính hiển vi quang học từ 500 đến 600 lần. Ký hiệu xác định bằng dấu cộng (+) theo quy định:
[/u]
+: có từ 1 đến 10 ký sinh trùng sốt rét/ 100 vi trường

++: có từ 11 đến 100 ký sinh trùng sốt rét/ 100 vi trường

+++: có từ 1 đến 10 ký sinh trùng sốt rét/ 1 vi trường

++++ : có trên 10 ký sinh trùng sốt rét/ 1 vi trường
Để bảo đảm độ chính xác trong đánh giá mật độ ký sinh trùng sốt rét, các cơ sở y tế ở tuyến trên thường thực hiện việc ghi mật độ bằng máy đếm cầm tay theo định lượng, xác định số lượng ký sinh trùng sốt rét/ mm3 máu theo công thức tính toán.

- Khả năng phát hiện ký sinh trùng sốt rét cũng tùy thuộc vào vị trí lấy máu như:

Lấy máu ở tủy xương có khả năng phát hiện ký sinh trùng sốt rét cao nhất nhưng kỹ thuật lấy máu phức tạp nên ít khi được sử dụng. Kỹ thuật này chỉ sử dụng đối với trường hợp các đối tượng bệnh nhân sốt rét dai dẳng, khó tìm thấy ký sinh trùng sốt rét trong máu ngoại vi.

Lấy máu ở trong da cũng có khả năng phát hiện ký sinh trùng sốt rét cao. Khi soi tiêu bản lam máu có thể phát hiện được tất cả các thể vô tính của ký sinh trùng như quá trình phát triển của ký sinh trùng sốt rét trong các vi mạch máu ở não. Tuy nhiên kỹ thuật lấy máu cũng phức tạp và kết quả chỉ có tính chất định tính, thường sử dụng kết quả xét nghiệm để tiên lượng bệnh nhân trong các trường hợp sốt rét ác tính.

Lấy máu ngoại vi thường dễ dàng làm tiêu bản lam máu, mọi đối tượng đều có thể áp dụng được. Tuy vậy, khả năng phát hiện ký sinh trùng sốt rét không cao.

Nhược điểm của phương pháp lấy tiêu bản lam máu, nhuộm giemsa và soi phát hiện hình thể ký sinh trùng sốt rét dưới kính hiển vi quang học là cần có thời gian đào tạo xét nghiệm viên đảm nhận công việc, trung bình phải mất khoảng hai năm để đào tạo nên khá tốn kém. Sau khi được đào tạo, nếu xét nghiệm viên không được đào tạo lại hoặc thường xuyên thực hiện kỹ thuật xét nghiệm phát hiện có thể quên hình thể của ký sinh trùng sốt rét, dẫn đến việc xác định bị nhầm lẫn, sai sót. Chất lượng kết quả phương pháp xét nghiệm này phụ thuộc vào trình độ, năng lực của xét nghiệm viên nên thường không khách quan. Vì vậy công tác tập huấn, đào tạo lại kỹ năng thực hành cho các xét nghiệm viên ở những cơ sở y tế là một hoạt động cần thiết phải được thực hiện hàng năm; đặc biệt đối với xét nghiệm viên còn yếu kém được phát hiện qua công tác kiểm tra kỹ thuật lam máu định kỳ ở tuyến dưới.

Mặc dù phương pháp chẩn đoán ký sinh trùnng sốt rét này là một kỹ thuật cổ điển, truyền thống nhưng cho đến nay nó vẫn còn mang những giá trị nhất định, nhất là các cơ sở y tế ở tuyến đầu chưa có điều kiện để trang bị các phương tiện chẩn đoán hiện đại.

---

theo quy định của Bộ Y tế, một bệnh nhân sốt rét phải được thực hiện đủ số lam máu xét nghiệm ký sinh trùng sốt rét theo yêu cầu của từng trường hợp. Nếu bệnh nhân có kết quả xét nghiệm lần đầu âm tính, phải thực hiện thêm lam máu thứ 2 và thứ 3, cách nhau 8 giờ để xác định; không được chỉ lấy duy nhất một lần lam máu. Trong bệnh án phải có ít nhất 3 phiếu ghi kết quả xét nghiệm ký sinh trùng sốt rét nếu muốn chẩn đoán người bệnh này mắc sốt rét lâm sàng, không phát hiện được ký sinh trùng sốt rét. Đối với bệnh nhân xét nghiệm lam máu lần đầu tiên (ngày D0) có kết quả ký sinh trùng dương tính, phải thực hiện thêm một lam máu vào ngày thứ 3 (ngày D2) để theo dõi đáp ứng điều trị và một lam máu xác định kết quả âm tính trước khi ra viện; nếu có điều kiện về thời gian điều trị nội trú cần thực hiện lam máu sau 1 tuần (ngày D7) và cho ra viện khi kết quả lam máu âm tính. Trong bệnh án cũng phải có ít nhất 3 phiếu ghi kết quả xét nghiệm ký sinh trùng sốt rét của 3 lam máu thực hiện vào các ngày D0, D2 và D7 hoặc lam máu âm tính trước khi ra viện nếu người bệnh không điều trị nội trú đủ 1 tuần.

các anh chị ơi, giúp em với ạ.
trong lúc bệnh nhân đang lên cơn sốt rét thì thể nào của ký sinh trùng sốt rét tập trung nhiều ở máu ngoại vi ạ? hay là cả 3 thể ạ?
em cảm ơn rất nhiều ạ.

(04-19-2014, 06:21 PM)Đỗ Bích Hạnh Đã viết: các anh chị ơi, giúp em với ạ.
trong lúc bệnh nhân đang lên cơn sốt rét thì thể nào của ký sinh trùng sốt rét tập trung nhiều ở máu ngoại vi ạ? hay là cả 3 thể ạ?
em cảm ơn rất nhiều ạ.

Thể nào cũng có bạn ạ

E muốn hỏi là tại sao khi soi tiêu bản thấy tư dưỡng trẻ mà chưa chắc chắn là P.falci hay P.vivax thì có thể cho phép kết luận là của P.falci ạ?

Các anh chị cho em hỏi là yếu tố nào làm cho tiêu bản được đẹp, thấy rõ các chi tiết của ký sinh trùng sốt rét với ạ! em xin chân thành cảm ơn! :d

(04-28-2012, 10:46 PM)tuyenlab Đã viết: Đã thử nhuộm thẳng bằng giemsa gốc chưa? Nhuộm 1 phút thôi! Xem có đẹp hơn giemsa 10% không?

ko ai nhuộm vậy đâu b.giếm sa sậm màu rất khó quan sát

(09-30-2014, 12:22 PM)hangxn11 Đã viết: E muốn hỏi là tại sao khi soi tiêu bản thấy tư dưỡng trẻ mà chưa chắc chắn là P.falci hay P.vivax thì có thể cho phép kết luận là của P.falci ạ?

theo mình thì thể tư dưỡng của P.falciparum và P.vivax mình thường soi theo kinh nghiệm thì thường so sánh với hồng cầu. ví dụ như tư dưỡng của plasmodium falciparum thì hình nhẫn chỉ chiếm 1/5 hay 1/6 của hồng cầu còn plasmodium vivax thì chiếm đến 1/2 hoặc 1/3 của hồng cầu.