1. THU THẬP BỆNH PHẨM
Có nhiều phương pháp lấy bệnh phẩm, việc quyết định chọn phương pháp nào dựa vào giá trị và giới hạn của mỗi phương pháp. Nếu bệnh phẩm không được lấy và xử lý đúng yêu cầu kỹ thuật, chúng ta có thể không phát hiện được mầm bệnh.
1.1. Chuẩn bị bệnh nhân trước khi lấy phân
Nhiều kết quả xét nghiệm phân là âm giả tạo do bệnh nhân không được hướng dẫn đầy đủ hay hướng dẫn không đúng cách. Phải hướng dẫn bệnh nhân một cách cẩn thận; tốt nhất là phòng thí nghiệm đưa cho bác sĩ điều trịnhững bản in sẵn những chi tiết cần thiết để phát cho bệnh nhân được chỉ định xét nghiệm phân.
Dặn bệnh nhân trong 3 ngày trước khi lấy bệnh phẩm, tránh dùng những loại thuốc và thực phẩm có thể làm cho việc nhận dạng KST khó khăn như:
– Thuốc: Bismuth, Magnesium, Kaolin, Baryte, thuốc đặt vào hậu môn có dầu, mỡ.
– Thực phẩm nhiều cặn bã: ngũ cốc, bắp cải, salad, quả có nhiều hạt nhỏ, nhiều chất béo, dầu, mỡ.
Bệnh nhân nên ăn chế độ ít chất bã như: bánh, đồ ăn loãng, trứng, sữa, gan,….
1.2. Lấy bệnh phẩm
1.2.1. Tại phòng xét nghiệm
Tốt nhất nên lấy phân tại phòng xét nghiệm.
– Lọ đựng phân:
+ Cần phải khô và sạch, bằng nhựa trong hoặc giấy carton không thấm nước hoặc thủy tinh.
+ Có miệng rộng, nắp vặn chặt.
+ Có dán nhãn đểghi họ, tên, tuổi, địa chỉcủa bệnh nhân và ghi ngày, giờ lấy bệnh phẩm.
– Cách lấy phân:
+ Có thể lấy bất cứ chỗ nào của khuôn phân để tìm trứng giun, sán. Nhưng để phát hiện đơn bào, nên lấy phân ở chỗ bất thường như máu, nhày, lỏng, bọt hoặc lấy phân ngay trong trực tràng.
+ Không được lấy phân lẫn với nước tiểu, dầu, các chất muối Mg, Al, Ba, Bi, Fe vì các chất đó làm biến dạng đơn bào.
+ Nếu cho bệnh nhân uống thuốc xổ, chỉnên cho uống sulfat natri và sẽlấy phân khi bệnh nhân đi ngoài lần thứ hai hay thứ ba sau khi uống thuốc.
– Lượng phân cần lấy:
+ Thay đổi tùy theo mục đích và kỹ thuật xét nghiệm, thường chỉ cần khoảng 5 – 10 gam phân (khoảng bằng hạt lạc) để có thể đủ làm nhiều phương pháp.
+ Trong một số trường hợp như tìm giun, đốt sán, các bệnh về bộ tiêu hoá phải lấy toàn bộ số lượng phân được thải ra để có thể thấy được KST và màng nhày hay mô bì bị tróc ra cùng với phân.
1.2.2. Ngoài phòng xét nghiệm
Lấy phân ở ngoài phòng xét nghiệm là điều bất đắc dĩ, cần tôn trọng những nguyên tắc sau:
– Phải gửi đến phòng xét nghiệm trong thời gian ngắn nhất, đặc biệt là đơn bào, phân phải luôn được giữ ấm.
– Không được giữ ở nhiệt độ lạnh quá.
– Nếu ở xa: giữ hộp phân trong nước ấm 37oC và đồng thời lấy một chút phân cho vào một trong những dung dịch cố định:
+ MIF: Merthiolate Iod Formol.
PVA: Polyvinyl Alcohol.
F2AM: Formol + Phenol + Alcool + Xanh Methylene.
1.3. Thời gian xét nghiệm phân
Sau khi thu hồi bệnh phẩm cần xét nghiệm ngay, càng sớm càng tốt. Thời gian từ khi lấy mẫu đến khi khảo sát:
– Phân bình thường cần xét nghiệm trong vòng 12 – 24 giờhoặc có thể để1 – 2 ngày trong tủ lạnh.
– Phân mềm, nhão, lỏng hay có màng nhày và máu cần phải xem ngay trong vòng 30 phút sau khi lấy.
Trong trường hợp sau khi lấy phân mà chưa xét nghiệm ngay hoặc lấy phân tại nhà ở xa, nên bảo quản phân bằng cách để phân trong các dung dịch định hình (fixative) đểtrứng giun, sán không phát triển, đơn bào không bị thoái hóa.
2. HÓA CHẤT BẢO QUẢN PHÂN
– để bảo quản hình thể và ngăn sự phát triển tiếp tục của trứng và ấu trùng giun, sán, phân được đựng
trong chất bảo quản ngay lập tức sau khi lấy (bệnh nhân lấy) hoặc khi phòng xét nghiệm nhận bệnh phẩm.
– Một số chất cố định được ưa dùng là: formol, sodium acetat–acetic acid–formol(SAF), dung dịch
Schaudinn, polyvinyl alcohol (PVA).
– Khi chọn phương pháp cố định, phải đảm bảo chất cố định được chọn phù hợp với kỹ thuật xét nghiệm sẽ làm. Vì mỗi chất cố định có tính chất riêng, không thể dùng cho tất cả các loại kỹ thuật xét nghiệm.
2.1. Formol
[table=95][tr][td]Cách pha chế dung dịch Formol[/td][td]10%[/td][td]5%[/td][/tr][tr][td]Formaldehyd 40% (USP)[/td][td]100ml[/td][td]50ml[/td][/tr][tr][td]NaCl 0.85%[/td][td]900ml[/td][td]950ml[/td][/tr][/table]
Formol đặc biệt thích hợp để cố định ấu trùng giun, sán và bào nang đơn bào. Hai nồng độ thường dùng là 5% cho bào nang đơn bào và 10% cho trứng và ấu trùng giun, sán.
Để giữ hình dạng đơn bào được tốt, nên pha loãng formol với dung dịch đệm phosphat, tạo thành formol trung hòa.
Ghi chú: Formaldehyd bán thị trường thường chỉ 37 – 40% HCHO, tuy nhiên vẫn được xem là 100%.
Bào nang đơn bào, trứng nang của trùng bào tử, trứng giun, sán và ấu trùng được bảo quản lâu dài trong formol 10%. Formol nóng (60oC) có thể dùng đối với bệnh phẩm có trứng giun, sán (vì trong formol lạnh, một vài loại trứng dày sẽ tiếp tục phát triển, gây nhiễm và sống trong một thời gian dài).
Lấy vài gram phân trộn kỹ trong dung dịch formol 5 – 10%.
Ưu điểm:
– Cố định toàn bộphân.
– Pha chếdễ, bảo quản lâu.
– Cặn lắng có thể làm thử nghiệm miễn dịch.
Nhược điểm:
– Không bảo quản thểhoạt động.
– Hình dạng KST không đẹp trên phết nhuộm cố định.
2.2. Sodium acetat – acetic acid formol (SAF)
SAF được dùng để bảo quản trứng và ấu trùng giun, sán, bào nang và thể hoạt động đơn bào, trứng nang trùng bào tửvà bào tử Microsporidia.
Bệnh phẩm cố định trong SAF đều dùng được với phương pháp tập trung phân và làm phết nhuộm cố định. Khi làm phết phân để nhuộm, nên trộn thêm albumin vào phân để tăng độ dính của bệnh phẩm vào lam kính.
SAF được coi là chất cố định mềm hơn thủy ngân clorua. Hình dạng KST sẽ không sắc nét bằng khi cố định trong dung dịch có thủy ngân clorua. Kết hợp cố định SAF với nhuộm hematoxylin sắt cho hình dạng tốt hơn nhuộm Trichrome.
– Thành phần:
[table=95][tr][td]Sodium acetat[/td][td]1.5g[/td][/tr][tr][td]Acid acetic băng[/td][td]2ml[/td][/tr][tr][td]Formaldehyd 40%[/td][td]4ml[/td][/tr][tr][td]Nước cất[/td][td]92ml[/td][/tr][/table]
Pha chế Albumin Mayer:trộn một thể tích lòng trắng trứng với một thể tích glycerin. Cho một giọt hỗn hợp này lên lam kính, cho thêm một giọt cặn lắng phân SAF, trộn đều, để khô ở nhiệt độ phòng 30 phút rồi nhuộm.
Ưu điểm:
– Dùng cho tiêu bản tập trung và cố định.
– Không có hợp chất thủy ngân.
– Dễ pha chế, bảo quản lâu.
– Cặn lắng có thể làm kỹ thuật miễn dịch men.
Nhược điểm:
Bệnh phẩm ít bám vào lam kính.
2.3. Dung dịch Schaudinn
được dùng với phân tươi hoặc bệnh phẩm niêm mạc ruột, có thể dùng cho tiêu bản nhuộm cố định và phương pháp tập trung.
Cách pha chế:
Dung dịch thủy ngân clorua bão hoà:
[table=95][tr][td]HgCl2[/td][td]110g[/td][/tr][tr][td]Nước cất[/td][td]1000ml[/td][/tr][/table]
Dùng một cốc để chưng, đun sôi đến khi thủy ngân clorua tan. đểyên vài giờ đến khi tạo tinh thể.
Dung dịch cố định Schaudinn (dung dịch mẹ):
[table=95][tr][td]Dung dịch thủy ngân clorua bão hòa[/td][td]600ml[/td][/tr][tr][td]Cồn ethylic 95o[/td][td]300ml[/td][/tr][/table]
Thêm 5ml acid acetic lạnh vào 100ml dung dịch mẹngay khi sử dụng.
Ưu điểm:
– Cố định tiêu bản từ mẫu phân tươi hoặc niêm mạc ruột.
– Bảo quản tốt thểhoạt động và bào nang đơn bào.
Nhược điểm:
– Không khuyến cáo dùng trong phương pháp tập trung.
– Dung dịch có chứa thủy ngân clorua, nên đặt ra vấn đề xử lý nước thải.
– Ít dính với bệnh phẩm lỏng hoặc nhày.
2.4. Polyvinyl alcohol (PVA)
PVA là một nhựa dẻo phối hợp với dung dịch cố định Schaudinn. Bột PVA được dùng như chất dính
cho bệnh phẩm phân khi hỗn hợp phân – PVA được trải trên lam kính, còn việc cố định vẫn là dung dịch Schaudinn.
Dung dịch cố định PVA được dùng đểbảo quản tất cảcác thểcủa KST đường ruột, nhất là bào nang và thể hoạt động đơn bào cho những kỹ thuật chuyên sâu.
PVA cũng được dùng đểcố định bệnh phẩm cần gửi qua bưu điện đến những phòng thí nghiệm chuyên sâu, rất tốt với bệnh phẩm lỏng và pha theo tỷ lệ 3 phần PVA với 1 phần phân.
Cách pha chế:
[table=95][tr][td]PVA[/td][td]10g[/td][/tr][tr][td]Cồn ethylic 95o[/td][td]62.5ml[/td][/tr][tr][td]Dung dịch thủy ngân clorua bão hòa[/td][td]125ml[/td][/tr][tr][td]Acid acetic băng[/td][td]10ml[/td][/tr][tr][td]Glycerin [/td][td]6ml[/td][/tr][/table]
Trộn các dịch lỏng vào cốc 500ml, thêm bột PVA vào (không khuấy). đậy cốc bằng đĩa Petri lớn, giấy sáp hoặc lá kim loại, để qua đêm. đun từ từ đến 75oC, lấy cốc ra và khuấy trong khoảng 30 phút đến khi có dung dịch đồng nhất như sữa.
Ưu điểm:
– Có thể làm tiêu bản cố định và phương pháp tập trung.
– Bảo quản tốt bào nang và thể hoạt động đơn bào.
– Bảo quản lâu (hàng năm) trong lọ kín ởnhiệt độphòng.
– Bệnh phẩm có thể gửi bằng bưu điện đến phòng thí nghiệm chuyên sâu.
– Trứng Trichuris trichura và bào nang Giardia lambia trong phương pháp tập trung dễ nhận ra như trong phương pháp formol–ether.
Nhược điểm:
– Hình dạng ấu trùng Strongyloides stercoralis không đẹp như cố định bằng formol. Trứng nang Isospora belli có thể không quan sát được (formol tốt hơn).
– Dung dịch có chứa thủy ngân, nên đặt ra vấn đề xử lý nước thải.
– Có thể trở nên trắng và sệt do mất nước hay do làm lạnh.
– Khó pha chế trong phòng thí nghiệm.
– Không thể dùng tiêu bản để làm kỹ thuật miễn dịch men.
2.5. PVA cải tiến
PVA được cải tiến không chứa thủy ngân, mà thay vào đó người ta dùng sulfat đồng hoặc sulfat kẽm.
Sulfat đồng không cho kết quả tốt như thủy ngân clorua. Sulfat kẽm được dùng trong nhuộm Trichrome.
Ưu điểm:
– Dùng được cho phết nhuộm cố định và phương pháp tập trung.
– Không chứa thủy ngân.
– Cố định bằng sulfat kẽm cho kết quả tốt hơn vì thế nhiều người thích dùng PVA có chứa sulfat kẽm hơn sulfat đồng.
Nhược điểm:
– Hình dạng của bào nang và thểhoạt động đơn bào khó thấy khi cố định bằng sulfat đồng, đặc biệt khi so sánh với thủy ngân clorua.
– đặc điểm cấu tạo của đơn bào khi nhuộm không ổn định: có thểrõ, có thểkhông rõ. Vì vậy, việc định danh có thể gặp khó khăn, đặc biệt đối với những bào nang của đơn bào nhỏ như Endolimax nana.
3. KỸ THUẬT LƯU GIỮKÝ SINH TRÙNG TRONG BỆNH PHẨM
Giữ bệnh phẩm ở 40oC, có thể giữ được trứng giun, sán và bào nang đơn bào nhiều ngày, nhiều tuần mà vẫn có thể định danh được dễ dàng. Muốn giữlâu phải dùng dung dịch định hình.
3.1. Trứng, ấu trùng giun, sán và bào nang đơn bào
a) Lưu giữ trên tiêu bản làm từ phân ướt
– để tránh loang phải dùng lam kính sạch, rửa sạch mỡ trong dung dịch đồng thể tích cồn – ether.
– để tránh khô do tiếp xúc với không khí, không bay hơi, người ta hàn tiêu bản bằng:
+ Vaselin: mẫu không giữlâu hơn vài giờ, dùng đểquan sát KST sống.
+ Paraffine:
Loại paraffine dùng cho mô học, hơnóng chảy hay để ởtủ ấm 56oC. Phương pháp này dễ thực hiện nhưng tiêu bản dễ bị vỡ khi va chạm.
+ Thuốc sơn móng tay:
* Phải để tiêu bản bốc hơi, khô bớt ở viền hàn, ấn xem còn hở không. Sau đó hàn lần thứ 2 và để khô.
Phương pháp này giản dị không cần dụng cụ đặc biệt.
* Nếu hàn kín, mẫu lưu giữtốt, trứng giun, sán còn nguyên vẹn; ngược lại bào nang và dạng hoạt động lưu giữ không tốt.
b) Lưu giữKST lâu dài
Dùng dung dịch formol mà nồng độ tùy thuộc vào độ cứng của phân (phân rắn dùng formol 5%; phân sệt: formol 10%), phân có trứng giun có sức chịu đựng cao (20%, F2AM).
– Quy trình thực hiện:
Cho phân vào dung dịch cố định theo thể tích:
1 thể tích phân + 3 thể tích dung dịch bảo quản.
Nghiền đều, lược qua lưới kim loại đểloại những cặn bã lớn.
để 1 phút ở bình thủy tinh có chân đểloại trừ những phần tử nặng.
đổ phần trên vào chai có nút và có nhãn.
Ghi KST có trong mẫu, ngày lấy mẫu, nồng độ dung dịch cố định.
+ KST được giữtốt ởcặn lắng trong chai.
+ để làm giảm sự bốc hơi của formol, thêm vào dung dịch bảo quản 10% glycerine.
đối với dạng hoạt động của amíp.
+ Dùng dung dịch cố định và lưu giữ kể trên, dung dịch formol 10% chỉ giữ được amíp vài tuần, sau đó amíp sẽ bị ly giải.
+ Dung dịch MIF: dung dịch này đắt tiền nhưng giữ được dạng hoạt động của amíp nhiều năm.
+ Dung dịch PVA: giữ được dạng hoạt động của amíp và có thể làm phết nhuộm Hematoxyline sắt.
đối với dạng hoạt động của trùng roi đường ruột:
Những cách kể trên đều dùng được nhưng không tốt vì những dạng hoạt động thường thu tròn lại, không thấy được như khi quan sát trực tiếp. Dung dịch tương đối tốt là MIF, F2AM.
3.2. Giun, sán trưởng thành
a) Giun, sán tìm thấy đã chết trong phân
– Ít có giá trịvì chúng thường đã bịhủy hoại.
– Hóa chất thường dùng là formol 5% hoặc cồn ethylic 70o.
b) Giun, sán còn sống trong phân
– Rửa bằng nước muối sinh lý.
– Phương thức cố định thay đổi tùy theo loại giun, sán:
+ Giun:
* Lấy giun ra khỏi nước rửa đểtrong hộp Petri hay bát sứ.
* đổngay cồn ethylic 70osôi (đun sôi cồn trong bình Erlenmeyer có khuấy từ). Cách cố định này làm giãn giun ngay lập tức.
* Giữtrong bình thủy tinh có nút mài. Không đậy bằng nút bấc hay cao su vì sẽ làm hư mẫu mau chóng.
Lưu ý:
* Không cố định bằng cồn lạnh.
* Không làm chết giun trong NaCl 0,85%.
* Không dùng dung dịch formol.
+ Sán dây và sán lá:
* Kẹp sán giữa 2 lam kính ởtrạng thái trải rộng, để cả trong hộp Petri lớn.
* Cho dung dịch cố định:
•Cồn ethylic 70o sôi.
•Dung dịch đồng thểtích dung dịch formol 10% và cồn 70o sôi. Ngâm sán tối thiểu nửa giờ rồi mới lấy sán ra.
Lưu mẫu:
* Bỏ dung dịch cố định.
* Lưu mẫu trong cồn 70o, trong chai thủy tinh nút mài hoặc nút cao su.
c) Loại giun có kích thước nhỏ
– đểtừng lô giun trong ống nghiệm chứa cồn ethylic 70o, đậy nút bông gòn không thấm nước, bao miệng.
– Phải dán nhãn, viết ngày bằng bút mực tàu, bút mỡ.
– để cả lô vào bình có nắp, dưới lót bông thấm nước, đổ đầy cồn ethylic 70o, đậy nắp. Tránh cồn bay hơi (nắp phải có vòng cao su).
3.3. Những điều cần biết khi lưu giữ KST lâu dài
– Giun mất độtrong và màu tự nhiên: khi bịcố định trở nên đục và hơi trắng nhưng giữ được rất lâu trong cồn.
– Trứng giun, sán thì dễ nhận nhưng không giống hệt như trong phân tươi. Vài loại trứng như trứng giun đũa, trứng giun móc sẽ bị phân bào nếu dung dịch cố định không đủ nồng độ (dạng phân bào không bao giờ gặp trong phân tươi).
– Bào nang đơn bào ở dạng tươi thì nhân có màu kém. Sau một thời gian lưu, những nhân này không nhuộm màu nhưng lại rõ hơn là ởtrạng thái tươi.
– Dạng hoạt động của amíp mất nhanh chóng độ chiết quang trong dung dịch formol.
– Trong MIF, amíp không bịly giải, nhận ra dễ. Ngược lại, sau khi để trên lam kính và đậy bằng lá kính,
màu của chúng biến mất, không thểdùng làm mẫu để lâu dài trên lam kính và lá kính.
CÂU HỎI LƯỢNG GIÁ
1. Thếnào là thu thập phân đúng quy cách?
2. đối với anh (chị), điều gì quan trọng trong khâu thu thập phân?
3.Theo anh (chị) hiện nay, các phòng xét nghiệm trong nước ta có chú trọng đến việc lấy bệnh phẩm? và
kết quảcủa việc có/không chú trọng đến việc lấy bệnh phẩm là gì?
4.Bảo quản bệnh phẩm có ích lợi gì?
5.Nêu tên những hóa chất bảo quản phân thường được dùng, cho biết ưu và nhược điểm của từng hóa chất bảo quản được nêu.
6.Cách bảo quản đơn bào khác với cách bảo quản giun, sán nhưthếnào?
7.Hóa chất bảo quản có ảnh hưởng gì đến KST khi KST được ngâm trong thời gian lâu dài?
Có nhiều phương pháp lấy bệnh phẩm, việc quyết định chọn phương pháp nào dựa vào giá trị và giới hạn của mỗi phương pháp. Nếu bệnh phẩm không được lấy và xử lý đúng yêu cầu kỹ thuật, chúng ta có thể không phát hiện được mầm bệnh.
1.1. Chuẩn bị bệnh nhân trước khi lấy phân
Nhiều kết quả xét nghiệm phân là âm giả tạo do bệnh nhân không được hướng dẫn đầy đủ hay hướng dẫn không đúng cách. Phải hướng dẫn bệnh nhân một cách cẩn thận; tốt nhất là phòng thí nghiệm đưa cho bác sĩ điều trịnhững bản in sẵn những chi tiết cần thiết để phát cho bệnh nhân được chỉ định xét nghiệm phân.
Dặn bệnh nhân trong 3 ngày trước khi lấy bệnh phẩm, tránh dùng những loại thuốc và thực phẩm có thể làm cho việc nhận dạng KST khó khăn như:
– Thuốc: Bismuth, Magnesium, Kaolin, Baryte, thuốc đặt vào hậu môn có dầu, mỡ.
– Thực phẩm nhiều cặn bã: ngũ cốc, bắp cải, salad, quả có nhiều hạt nhỏ, nhiều chất béo, dầu, mỡ.
Bệnh nhân nên ăn chế độ ít chất bã như: bánh, đồ ăn loãng, trứng, sữa, gan,….
1.2. Lấy bệnh phẩm
1.2.1. Tại phòng xét nghiệm
Tốt nhất nên lấy phân tại phòng xét nghiệm.
– Lọ đựng phân:
+ Cần phải khô và sạch, bằng nhựa trong hoặc giấy carton không thấm nước hoặc thủy tinh.
+ Có miệng rộng, nắp vặn chặt.
+ Có dán nhãn đểghi họ, tên, tuổi, địa chỉcủa bệnh nhân và ghi ngày, giờ lấy bệnh phẩm.
– Cách lấy phân:
+ Có thể lấy bất cứ chỗ nào của khuôn phân để tìm trứng giun, sán. Nhưng để phát hiện đơn bào, nên lấy phân ở chỗ bất thường như máu, nhày, lỏng, bọt hoặc lấy phân ngay trong trực tràng.
+ Không được lấy phân lẫn với nước tiểu, dầu, các chất muối Mg, Al, Ba, Bi, Fe vì các chất đó làm biến dạng đơn bào.
+ Nếu cho bệnh nhân uống thuốc xổ, chỉnên cho uống sulfat natri và sẽlấy phân khi bệnh nhân đi ngoài lần thứ hai hay thứ ba sau khi uống thuốc.
– Lượng phân cần lấy:
+ Thay đổi tùy theo mục đích và kỹ thuật xét nghiệm, thường chỉ cần khoảng 5 – 10 gam phân (khoảng bằng hạt lạc) để có thể đủ làm nhiều phương pháp.
+ Trong một số trường hợp như tìm giun, đốt sán, các bệnh về bộ tiêu hoá phải lấy toàn bộ số lượng phân được thải ra để có thể thấy được KST và màng nhày hay mô bì bị tróc ra cùng với phân.
1.2.2. Ngoài phòng xét nghiệm
Lấy phân ở ngoài phòng xét nghiệm là điều bất đắc dĩ, cần tôn trọng những nguyên tắc sau:
– Phải gửi đến phòng xét nghiệm trong thời gian ngắn nhất, đặc biệt là đơn bào, phân phải luôn được giữ ấm.
– Không được giữ ở nhiệt độ lạnh quá.
– Nếu ở xa: giữ hộp phân trong nước ấm 37oC và đồng thời lấy một chút phân cho vào một trong những dung dịch cố định:
+ MIF: Merthiolate Iod Formol.
PVA: Polyvinyl Alcohol.
F2AM: Formol + Phenol + Alcool + Xanh Methylene.
1.3. Thời gian xét nghiệm phân
Sau khi thu hồi bệnh phẩm cần xét nghiệm ngay, càng sớm càng tốt. Thời gian từ khi lấy mẫu đến khi khảo sát:
– Phân bình thường cần xét nghiệm trong vòng 12 – 24 giờhoặc có thể để1 – 2 ngày trong tủ lạnh.
– Phân mềm, nhão, lỏng hay có màng nhày và máu cần phải xem ngay trong vòng 30 phút sau khi lấy.
Trong trường hợp sau khi lấy phân mà chưa xét nghiệm ngay hoặc lấy phân tại nhà ở xa, nên bảo quản phân bằng cách để phân trong các dung dịch định hình (fixative) đểtrứng giun, sán không phát triển, đơn bào không bị thoái hóa.
2. HÓA CHẤT BẢO QUẢN PHÂN
– để bảo quản hình thể và ngăn sự phát triển tiếp tục của trứng và ấu trùng giun, sán, phân được đựng
trong chất bảo quản ngay lập tức sau khi lấy (bệnh nhân lấy) hoặc khi phòng xét nghiệm nhận bệnh phẩm.
– Một số chất cố định được ưa dùng là: formol, sodium acetat–acetic acid–formol(SAF), dung dịch
Schaudinn, polyvinyl alcohol (PVA).
– Khi chọn phương pháp cố định, phải đảm bảo chất cố định được chọn phù hợp với kỹ thuật xét nghiệm sẽ làm. Vì mỗi chất cố định có tính chất riêng, không thể dùng cho tất cả các loại kỹ thuật xét nghiệm.
2.1. Formol
[table=95][tr][td]Cách pha chế dung dịch Formol[/td][td]10%[/td][td]5%[/td][/tr][tr][td]Formaldehyd 40% (USP)[/td][td]100ml[/td][td]50ml[/td][/tr][tr][td]NaCl 0.85%[/td][td]900ml[/td][td]950ml[/td][/tr][/table]
Formol đặc biệt thích hợp để cố định ấu trùng giun, sán và bào nang đơn bào. Hai nồng độ thường dùng là 5% cho bào nang đơn bào và 10% cho trứng và ấu trùng giun, sán.
Để giữ hình dạng đơn bào được tốt, nên pha loãng formol với dung dịch đệm phosphat, tạo thành formol trung hòa.
Ghi chú: Formaldehyd bán thị trường thường chỉ 37 – 40% HCHO, tuy nhiên vẫn được xem là 100%.
Bào nang đơn bào, trứng nang của trùng bào tử, trứng giun, sán và ấu trùng được bảo quản lâu dài trong formol 10%. Formol nóng (60oC) có thể dùng đối với bệnh phẩm có trứng giun, sán (vì trong formol lạnh, một vài loại trứng dày sẽ tiếp tục phát triển, gây nhiễm và sống trong một thời gian dài).
Lấy vài gram phân trộn kỹ trong dung dịch formol 5 – 10%.
Ưu điểm:
– Cố định toàn bộphân.
– Pha chếdễ, bảo quản lâu.
– Cặn lắng có thể làm thử nghiệm miễn dịch.
Nhược điểm:
– Không bảo quản thểhoạt động.
– Hình dạng KST không đẹp trên phết nhuộm cố định.
2.2. Sodium acetat – acetic acid formol (SAF)
SAF được dùng để bảo quản trứng và ấu trùng giun, sán, bào nang và thể hoạt động đơn bào, trứng nang trùng bào tửvà bào tử Microsporidia.
Bệnh phẩm cố định trong SAF đều dùng được với phương pháp tập trung phân và làm phết nhuộm cố định. Khi làm phết phân để nhuộm, nên trộn thêm albumin vào phân để tăng độ dính của bệnh phẩm vào lam kính.
SAF được coi là chất cố định mềm hơn thủy ngân clorua. Hình dạng KST sẽ không sắc nét bằng khi cố định trong dung dịch có thủy ngân clorua. Kết hợp cố định SAF với nhuộm hematoxylin sắt cho hình dạng tốt hơn nhuộm Trichrome.
– Thành phần:
[table=95][tr][td]Sodium acetat[/td][td]1.5g[/td][/tr][tr][td]Acid acetic băng[/td][td]2ml[/td][/tr][tr][td]Formaldehyd 40%[/td][td]4ml[/td][/tr][tr][td]Nước cất[/td][td]92ml[/td][/tr][/table]
Pha chế Albumin Mayer:trộn một thể tích lòng trắng trứng với một thể tích glycerin. Cho một giọt hỗn hợp này lên lam kính, cho thêm một giọt cặn lắng phân SAF, trộn đều, để khô ở nhiệt độ phòng 30 phút rồi nhuộm.
Ưu điểm:
– Dùng cho tiêu bản tập trung và cố định.
– Không có hợp chất thủy ngân.
– Dễ pha chế, bảo quản lâu.
– Cặn lắng có thể làm kỹ thuật miễn dịch men.
Nhược điểm:
Bệnh phẩm ít bám vào lam kính.
2.3. Dung dịch Schaudinn
được dùng với phân tươi hoặc bệnh phẩm niêm mạc ruột, có thể dùng cho tiêu bản nhuộm cố định và phương pháp tập trung.
Cách pha chế:
Dung dịch thủy ngân clorua bão hoà:
[table=95][tr][td]HgCl2[/td][td]110g[/td][/tr][tr][td]Nước cất[/td][td]1000ml[/td][/tr][/table]
Dùng một cốc để chưng, đun sôi đến khi thủy ngân clorua tan. đểyên vài giờ đến khi tạo tinh thể.
Dung dịch cố định Schaudinn (dung dịch mẹ):
[table=95][tr][td]Dung dịch thủy ngân clorua bão hòa[/td][td]600ml[/td][/tr][tr][td]Cồn ethylic 95o[/td][td]300ml[/td][/tr][/table]
Thêm 5ml acid acetic lạnh vào 100ml dung dịch mẹngay khi sử dụng.
Ưu điểm:
– Cố định tiêu bản từ mẫu phân tươi hoặc niêm mạc ruột.
– Bảo quản tốt thểhoạt động và bào nang đơn bào.
Nhược điểm:
– Không khuyến cáo dùng trong phương pháp tập trung.
– Dung dịch có chứa thủy ngân clorua, nên đặt ra vấn đề xử lý nước thải.
– Ít dính với bệnh phẩm lỏng hoặc nhày.
2.4. Polyvinyl alcohol (PVA)
PVA là một nhựa dẻo phối hợp với dung dịch cố định Schaudinn. Bột PVA được dùng như chất dính
cho bệnh phẩm phân khi hỗn hợp phân – PVA được trải trên lam kính, còn việc cố định vẫn là dung dịch Schaudinn.
Dung dịch cố định PVA được dùng đểbảo quản tất cảcác thểcủa KST đường ruột, nhất là bào nang và thể hoạt động đơn bào cho những kỹ thuật chuyên sâu.
PVA cũng được dùng đểcố định bệnh phẩm cần gửi qua bưu điện đến những phòng thí nghiệm chuyên sâu, rất tốt với bệnh phẩm lỏng và pha theo tỷ lệ 3 phần PVA với 1 phần phân.
Cách pha chế:
[table=95][tr][td]PVA[/td][td]10g[/td][/tr][tr][td]Cồn ethylic 95o[/td][td]62.5ml[/td][/tr][tr][td]Dung dịch thủy ngân clorua bão hòa[/td][td]125ml[/td][/tr][tr][td]Acid acetic băng[/td][td]10ml[/td][/tr][tr][td]Glycerin [/td][td]6ml[/td][/tr][/table]
Trộn các dịch lỏng vào cốc 500ml, thêm bột PVA vào (không khuấy). đậy cốc bằng đĩa Petri lớn, giấy sáp hoặc lá kim loại, để qua đêm. đun từ từ đến 75oC, lấy cốc ra và khuấy trong khoảng 30 phút đến khi có dung dịch đồng nhất như sữa.
Ưu điểm:
– Có thể làm tiêu bản cố định và phương pháp tập trung.
– Bảo quản tốt bào nang và thể hoạt động đơn bào.
– Bảo quản lâu (hàng năm) trong lọ kín ởnhiệt độphòng.
– Bệnh phẩm có thể gửi bằng bưu điện đến phòng thí nghiệm chuyên sâu.
– Trứng Trichuris trichura và bào nang Giardia lambia trong phương pháp tập trung dễ nhận ra như trong phương pháp formol–ether.
Nhược điểm:
– Hình dạng ấu trùng Strongyloides stercoralis không đẹp như cố định bằng formol. Trứng nang Isospora belli có thể không quan sát được (formol tốt hơn).
– Dung dịch có chứa thủy ngân, nên đặt ra vấn đề xử lý nước thải.
– Có thể trở nên trắng và sệt do mất nước hay do làm lạnh.
– Khó pha chế trong phòng thí nghiệm.
– Không thể dùng tiêu bản để làm kỹ thuật miễn dịch men.
2.5. PVA cải tiến
PVA được cải tiến không chứa thủy ngân, mà thay vào đó người ta dùng sulfat đồng hoặc sulfat kẽm.
Sulfat đồng không cho kết quả tốt như thủy ngân clorua. Sulfat kẽm được dùng trong nhuộm Trichrome.
Ưu điểm:
– Dùng được cho phết nhuộm cố định và phương pháp tập trung.
– Không chứa thủy ngân.
– Cố định bằng sulfat kẽm cho kết quả tốt hơn vì thế nhiều người thích dùng PVA có chứa sulfat kẽm hơn sulfat đồng.
Nhược điểm:
– Hình dạng của bào nang và thểhoạt động đơn bào khó thấy khi cố định bằng sulfat đồng, đặc biệt khi so sánh với thủy ngân clorua.
– đặc điểm cấu tạo của đơn bào khi nhuộm không ổn định: có thểrõ, có thểkhông rõ. Vì vậy, việc định danh có thể gặp khó khăn, đặc biệt đối với những bào nang của đơn bào nhỏ như Endolimax nana.
3. KỸ THUẬT LƯU GIỮKÝ SINH TRÙNG TRONG BỆNH PHẨM
Giữ bệnh phẩm ở 40oC, có thể giữ được trứng giun, sán và bào nang đơn bào nhiều ngày, nhiều tuần mà vẫn có thể định danh được dễ dàng. Muốn giữlâu phải dùng dung dịch định hình.
3.1. Trứng, ấu trùng giun, sán và bào nang đơn bào
a) Lưu giữ trên tiêu bản làm từ phân ướt
– để tránh loang phải dùng lam kính sạch, rửa sạch mỡ trong dung dịch đồng thể tích cồn – ether.
– để tránh khô do tiếp xúc với không khí, không bay hơi, người ta hàn tiêu bản bằng:
+ Vaselin: mẫu không giữlâu hơn vài giờ, dùng đểquan sát KST sống.
+ Paraffine:
Loại paraffine dùng cho mô học, hơnóng chảy hay để ởtủ ấm 56oC. Phương pháp này dễ thực hiện nhưng tiêu bản dễ bị vỡ khi va chạm.
+ Thuốc sơn móng tay:
* Phải để tiêu bản bốc hơi, khô bớt ở viền hàn, ấn xem còn hở không. Sau đó hàn lần thứ 2 và để khô.
Phương pháp này giản dị không cần dụng cụ đặc biệt.
* Nếu hàn kín, mẫu lưu giữtốt, trứng giun, sán còn nguyên vẹn; ngược lại bào nang và dạng hoạt động lưu giữ không tốt.
b) Lưu giữKST lâu dài
Dùng dung dịch formol mà nồng độ tùy thuộc vào độ cứng của phân (phân rắn dùng formol 5%; phân sệt: formol 10%), phân có trứng giun có sức chịu đựng cao (20%, F2AM).
– Quy trình thực hiện:
Cho phân vào dung dịch cố định theo thể tích:
1 thể tích phân + 3 thể tích dung dịch bảo quản.
Nghiền đều, lược qua lưới kim loại đểloại những cặn bã lớn.
để 1 phút ở bình thủy tinh có chân đểloại trừ những phần tử nặng.
đổ phần trên vào chai có nút và có nhãn.
Ghi KST có trong mẫu, ngày lấy mẫu, nồng độ dung dịch cố định.
+ KST được giữtốt ởcặn lắng trong chai.
+ để làm giảm sự bốc hơi của formol, thêm vào dung dịch bảo quản 10% glycerine.
đối với dạng hoạt động của amíp.
+ Dùng dung dịch cố định và lưu giữ kể trên, dung dịch formol 10% chỉ giữ được amíp vài tuần, sau đó amíp sẽ bị ly giải.
+ Dung dịch MIF: dung dịch này đắt tiền nhưng giữ được dạng hoạt động của amíp nhiều năm.
+ Dung dịch PVA: giữ được dạng hoạt động của amíp và có thể làm phết nhuộm Hematoxyline sắt.
đối với dạng hoạt động của trùng roi đường ruột:
Những cách kể trên đều dùng được nhưng không tốt vì những dạng hoạt động thường thu tròn lại, không thấy được như khi quan sát trực tiếp. Dung dịch tương đối tốt là MIF, F2AM.
3.2. Giun, sán trưởng thành
a) Giun, sán tìm thấy đã chết trong phân
– Ít có giá trịvì chúng thường đã bịhủy hoại.
– Hóa chất thường dùng là formol 5% hoặc cồn ethylic 70o.
b) Giun, sán còn sống trong phân
– Rửa bằng nước muối sinh lý.
– Phương thức cố định thay đổi tùy theo loại giun, sán:
+ Giun:
* Lấy giun ra khỏi nước rửa đểtrong hộp Petri hay bát sứ.
* đổngay cồn ethylic 70osôi (đun sôi cồn trong bình Erlenmeyer có khuấy từ). Cách cố định này làm giãn giun ngay lập tức.
* Giữtrong bình thủy tinh có nút mài. Không đậy bằng nút bấc hay cao su vì sẽ làm hư mẫu mau chóng.
Lưu ý:
* Không cố định bằng cồn lạnh.
* Không làm chết giun trong NaCl 0,85%.
* Không dùng dung dịch formol.
+ Sán dây và sán lá:
* Kẹp sán giữa 2 lam kính ởtrạng thái trải rộng, để cả trong hộp Petri lớn.
* Cho dung dịch cố định:
•Cồn ethylic 70o sôi.
•Dung dịch đồng thểtích dung dịch formol 10% và cồn 70o sôi. Ngâm sán tối thiểu nửa giờ rồi mới lấy sán ra.
Lưu mẫu:
* Bỏ dung dịch cố định.
* Lưu mẫu trong cồn 70o, trong chai thủy tinh nút mài hoặc nút cao su.
c) Loại giun có kích thước nhỏ
– đểtừng lô giun trong ống nghiệm chứa cồn ethylic 70o, đậy nút bông gòn không thấm nước, bao miệng.
– Phải dán nhãn, viết ngày bằng bút mực tàu, bút mỡ.
– để cả lô vào bình có nắp, dưới lót bông thấm nước, đổ đầy cồn ethylic 70o, đậy nắp. Tránh cồn bay hơi (nắp phải có vòng cao su).
3.3. Những điều cần biết khi lưu giữ KST lâu dài
– Giun mất độtrong và màu tự nhiên: khi bịcố định trở nên đục và hơi trắng nhưng giữ được rất lâu trong cồn.
– Trứng giun, sán thì dễ nhận nhưng không giống hệt như trong phân tươi. Vài loại trứng như trứng giun đũa, trứng giun móc sẽ bị phân bào nếu dung dịch cố định không đủ nồng độ (dạng phân bào không bao giờ gặp trong phân tươi).
– Bào nang đơn bào ở dạng tươi thì nhân có màu kém. Sau một thời gian lưu, những nhân này không nhuộm màu nhưng lại rõ hơn là ởtrạng thái tươi.
– Dạng hoạt động của amíp mất nhanh chóng độ chiết quang trong dung dịch formol.
– Trong MIF, amíp không bịly giải, nhận ra dễ. Ngược lại, sau khi để trên lam kính và đậy bằng lá kính,
màu của chúng biến mất, không thểdùng làm mẫu để lâu dài trên lam kính và lá kính.
CÂU HỎI LƯỢNG GIÁ
1. Thếnào là thu thập phân đúng quy cách?
2. đối với anh (chị), điều gì quan trọng trong khâu thu thập phân?
3.Theo anh (chị) hiện nay, các phòng xét nghiệm trong nước ta có chú trọng đến việc lấy bệnh phẩm? và
kết quảcủa việc có/không chú trọng đến việc lấy bệnh phẩm là gì?
4.Bảo quản bệnh phẩm có ích lợi gì?
5.Nêu tên những hóa chất bảo quản phân thường được dùng, cho biết ưu và nhược điểm của từng hóa chất bảo quản được nêu.
6.Cách bảo quản đơn bào khác với cách bảo quản giun, sán nhưthếnào?
7.Hóa chất bảo quản có ảnh hưởng gì đến KST khi KST được ngâm trong thời gian lâu dài?
giải thích)