Định lượng C-Peptid bằng máy miễn dịch tự động

[tuyenlab]

ĐỊNH LƯỢNG C-PEPTID

 

C-Peptide là một peptide gồm 31 acid amin, do tế bào beta của đảo tụy sản sinh từ proinsulin dưới tác dụng của enzym thủy phân là Protease theo phương trình sau:

 

Proinsulin (86 aa) + 4H2O → Insulin (51 aa) + C-Peptid (31 aa) + 4 aa

 

Lượng peptide và insulin do tế bào beta sản xuất và bài tiết với lượng như nhau vào  tuần hoàn máu. Tuy nhiên, do C-peptide được đào thải qua thận còn insulin được đào thải chủ yếu qua gan và cũng do thời gian bán hủy của C-peptide là khoảng 30 phút và của insulin là 5 phút nên nồng độ C-peptide trong máu thường cao hơn nồng độ insulin khoảng 5 lần. Việc định lượng C-peptide trong huyết tương có thể giúp đánh giá khả năng hoạt động của các tế bào beta của tụy nội tiết.

 
I . NGUYÊN LÝ

Định lượng C-peptid dựa trên nguyên lý miễn dịch theo kiểu “sandwich”. Sử dụng phương pháp điện hóa phát quang (ECLIA). Tổng thời gian của phản ứng là 18 phút.

 

+ Lần ủ đầu tiên: Gồm mẫu bệnh phẩm (huyết thanh, huyết tương), 1 kháng thể đơn dòng đặc hiệu với c-peptid đã được gắn với biotin và 1 kháng thể đơn dòng đặc hiệu với c-peptid được gắn với phức hợp ruthenium để tạo thành phức hợp kiểu sandwich

 

+ Lần ủ thứ hai: sau khi cho thêm các vi hạt được bao phủ bởi streptavidin, phức hợp sẽ bám vào phase rắn qua phản ứng của biotin và streptavidin

 

+ Phức hợp phản ứng được đưa vào buồng đo. Tại đây các vi hạt (microparticles) được giữ lại bằng từ tính trên bề mặt điện cực. Những chất thừa được rửa đi bằng procell. Dùng một dòng điện tác động vào điện cực nhằm kích thích phát quang và cường độ tín hiệu ánh sáng phát ra có thể đo được bằng bộ phận nhân quang.

 
+ Kết quả được tính toán dựa vào đường cong chuẩn thu được bằng cách chuẩn 2 điểm và đường cong gốc được cung cấp từ nhà sản xuất. Nồng độ c-peptid tỷ lệ thuận với cường độ ánh sáng thu được.
 
II. CHUẨN BỊ
 
1.      Người thực hiện: 01 cán bộ đại học chuyên ngành Hóa sinh miễn dịch và 01 kỹ thuật viên
 
2.      Phương tiện, hóa chất
 
2.1. Phương tiện

-    Các   máy   có    thể   phân   tích:    Elecsys    1010,   Elecsys   2010,   MODUL    R N     LYTICS E170,mn cobas e 411, cobas e 601 và một số máy khác
 
- Máy ly tâm
 
- Tủ lạnh để bảo quản hóa chất và bảo quản QC, mẫu bệnh phẩm
 
- Pipet các loại
 
- Ống nghiệm, đầu côn xanh và vàng
 
- Giá đựng ống nghiệm
 
2.2. Hóa chất
 
+ Thuốc thử 1 (M)- nắp trong, có thể tích 6.5 mL: gồm các vi hạt được bao phủ Streptavidin 0.72 mg/mL; chất bảo quản.
 

+ Thuốc thử 2 (R1)- nắp màu ghi, có    nti- c-peptid -  b~biotin, thể tích 9 mL: Biotinylated monoclonal anti- c-peptid antibody (mouse)  1 mg/L; đệm phosphat 50 mmol/L, pH 6.0; chất bảo quản.

 

+Thuốc thử 3 (R2) nắp màu đen, có    nti- c-peptid -  b~3 Ru(bpy), thể tích 9 mL: trong đó kháng thể kháng C-peptid được đánh dấu bởi phức hợp ruthenium:   0.4 mg/L; đệm phosphat: 50 mmol/L, pH 6.0; chất bảo quản.

+ Bảo quản thuốc thử: ở nhiệt độ 2- 8oC, có thể ổn định đến thời hạn ghi trên hộp. Thuốc thử sau khi mở nắp bảo quản được 12 tuần ở 2-8oC. Nếu để trên máy (không tắt máy) có thể được 4 tuần.

 
+ Procell; Clean cell
 
+ Dung dịch chuẩn
 
+ Quality control (QC): gồm 3 mức: level 1, 2 và 3
 
2.3. Các dụng cụ tiêu hao khác
 
- Ống nghiệm
 
- Găng tay, dây garo
 
- Bông, cồn sát trùng, bơm tiêm hoặc kim lấy máu
 
3.  Người bệnh
 
Cần giải thích cho người bệnh và người nhà về mục đích và ý nghĩa của xét nghiệm
 
Người bệnh cần nhịn ăn 10giờ tính đến thời điểm lấy máu.
 
4. Phiếu xét nghiệm
 
Có y lệnh của bác sỹ lâm sàng ghi trên phiếu xét nghiệm
 
III. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

1.      Lấy bệnh phẩm
 
- Phân tích trên mẫu máu, có thể dùng: huyết thanh hoặc huyết tương: chất chống đông Li-heparin, EDTA
 
- Phân tích trên mẫu nước tiểu: cần lấy mẫu nước tiểu 24giờ
 
Tính ổn định của mẫu: mẫu huyết thanh, huyết tương và nước tiểu 24giờ có thể ổn định 4 giờ /nhiệt độ 15-25oC; 24 giờ / nhiệt độ 2-8oC; 30 ngày/nhiệt độ (-20oC)
 
2.  Tiến hành kỹ thuật
 
2.1. Chuẩn bị máy phân tích
 
Dựng đường chuẩn
 
Phân tích QC:  ở cả 3 level. Khi QC đạt tiến hành phân tích mẫu
 
2.2. Phân tích mẫu
 
Mẫu bệnh phẩm nên được tiến hành phân tích trong vòng 2giờ
 
Mẫu sau khi ly tâm được chuyển vào khay đựng bệnh phẩm
 
Đánh số (hoặc ID của người bệnh); chọn test và vận hành theo protocol của máy.
 
III. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
 
Trị số tham khảo: dựa trên nghiên cứu sau:

Hệ số chuyển đổi:

 
- ng/mL (mg/L) x 0,33333= nmol/L
ng/mL x 333,33= pmol/L

 - nmol/L x 3,0= ng/mL
pmol/L x 0,003 = ng/mL

C- peptid tăng trong:
 
- Khối u insulin (Insulinoma)
 
- Sản xuất insulin nội sinh tăng: cơ thể đáp ứng với sự tăng glucose máu do ăn nhiều glucose hoặc do kháng insulin.
 
- Ghép tụy


C- peptid giảm trong: Đái tháo đường type 1, sau cắt tụy
 
IV. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
 
- Các yếu tố có thể ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm khi: Bilirubin > 855mmol/L (> 50mg/dL); Hemoglobin > 0,186 mmol/L (> 0,3 g/dL), Triglycerid > 22,58 mmol/L  (2000mg/dL);  biotin  >  246  nmol/L  (> 60ng/mL);  Yếu  tố  dạng  thấp  > 1200IU/mL.
 
- Xử trí: Khi lấy mẫu máu người bệnh cần nhịn ăn 10h tính đến thời điểm lấy máu để phân tích.