Đặc tính một số môi trường phân lập và chẩn đoán vi khuẩn gây bệnh
Trong phòng thí nghiệm y tế, để phân lập và định danh vi khuẩn gây bệnh cần phải sử dụng đến nhiều loại môi trường nuôi cấy và hoá chất thích hợp cho một số thử nghiệm, đặc biệt là thử nghiệm sinh hoá. Bên cạnh đó, việc đánh giá chất lượng pha chế môi trường đúng quy cách cũng là một trong những khâu quan trọng trong công tác xét nghiệm vi khuẩn.
Cho đến nay, có nhiều loại môi trường khác nhau được dùng cho phân lập và định danh vi khuẩn, và thường được xếp thành 3 loại chủ yếu là: môi trường nuôi cấy cơ bản, môi trường tăng sinh vi khuẩn (có giầu chất dinh dưỡng) và môi trường nuôi cấy chọn lọc. Mỗi loại môi trường sẽ được sử dụng với những mục đích khác nhau trong nuôi cấy, phân lập và định danh vi sinh vật có trong mẫu xét nghiệm của bệnh nhân.
1. MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY THÔNG THƯỜNG
1.1. Môi trường Chocolate agar
Môi trường thạch chocolate là môi trường giầu dinh dưỡng và thường được dùng cho vi khuẩn Haemophilus, S.pneumoniae và các loài vi khuẩn khó phát triển khác. Đây là môi trường thạch máu cừu, khi thêm máu cừu vào môi trường cơ bản trong điều kiện nhiệt độ đủ để giải phóng tế bào hồng cầu và nicotinamid - adenin dinucleotid (NAD). Môi trường đổ đĩa được bảo quản ở 40C. Đĩa môi trường đã cấy bệnh phẩm được ủ ấm ở nhiệt độ 350C trong khí trường có 5% CO2, thời gian 18 – 24 giờ, quan sát sự phát triển của vi khuẩn.
1.2. Môi trường Simmons citrate
Môi trường thạch Cimmons citrate được sử dụng cho các trực khuẩn đường ruột gram âm khác nhau. Giống như nguyên lý sử dụng môi trường acetat của vi khuẩn, để phân biệt các loại vi khuẩn người ta dựa vào sự khác biệt do khả năng sử dụng citrate như là nguồn carbon duy nhất của chủng phân lập. Môi trường có pH khoảng 6,9. Ống môi trường sau khi cấy huyền dịch vi khuẩn lên mặt nghiêng, để tủ ấm 35oC, quan sát sự thay đổi trong 4 ngày.
1.3. Môi trường Deoxychocolate citrate
Thạch Deoxychocolate citrate là môi trường chọn lọc, môi trường khác nhau dùng cho phân lập trực tiếp các căn nguyên gây bệnh đường ruột từ phân và bệnh phẩm nước tiểu hoặc gián tiếp từ canh thang giầu dinh dưỡng như selenite-F. Các thành phần chọn lọc có trong môi trường như citrate natri và deoxycholate natri đã phối hợp với nhau để ức chế các trực khuẩn đường ruột khác mà không phải là căn nguyên gây bệnh nguy hiểm.
Thành phần khác nhau ở đây là lactose, căn nguyên gây bệnh đường ruột không lên men đường sẽ xuất hiện các khuẩn lạc không màu. Nếu lên men đường lactose, xuất hiện những khuẩn lạc chuyển từ màu hồng sang màu đỏ, đó là kết quả của sự thay đổi pH trong quá trình lên men đường lactose.
Cấy khuẩn lạc lên môi trường đổ đĩa, ủ ấm 350C/48 giờ. Chất nuôi cấy mà nhiều như mẫu phân, nước tiểu, hoặc các chất khác của cơ thể thì có thể cấy trực tiếp vào môi trường, ngược lại nếu chất nuôi cấy ít thì nên làm thêm một bước là cấy vào môi trường tăng sinh trước rồi mới cấy vào môi trường chọn lọc.
1.4. Môi trường Kligler Iron Agar (KIA)
Môi trường thạch Kligler Iron Agar được sử dụng để nuôi cấy trực tiếp cho trực khuẩn gram âm lên men đường glucose, đây là đặc điểm cơ bản trong phân loại bước đầu của các trực khuẩn gram âm. Môi trường này cũng đồng thời thử tính lên men đường lactose, sinh hơi trong quá trình lên men carbohydrat và sinh H2S. Tất cả những đặc điểm đó đã được sử dụng cho các trực khuẩn gram âm thuộc họ vi khuẩn đường ruột.
Môi trường KIA gồm glucose và lactose (có thể lên men carbohydrat), đỏ phenol (chỉ thị pH), pepton (nguồn carbon/nitrogen) và muối sắt cộng với thiosulfate natri. Có 3 hình thái lên men carbohydrat có thể xảy ra là:
- Acid (màu vàng) phần gốc và kiềm (màu đỏ) phần nghiêng của môi trường, khi đó cho thấy vi sinh vật lên men đường glucose nhưng không lên men đường lactose.
- Acid (màu vàng) phần gốc và acid (màu vàng) phần nghiêng của môi trường, khi đó cho thấy vi sinh vật lên men cả đường glucose và đường lactose.
- Kiềm (màu đỏ) phần gốc và kiềm (màu đỏ) phần nghiêng môi trường, khi đó cho thấy vi sinh vật không thể lên men đường glucose và đường lactose. Các sản phẩm sinh ra không phải là sản phẩm acid.
Nếu sinh hơi, có hơi ở phần gốc của ống môi trường, môi trường bị chia cắt hoặc đẩy môi trường lên khỏi đáy ống. Nếu thấy màu đen ở phần gốc ống, vi sinh vật đã sinh ra hydrogen sulfid gas từ thiosulfid. Phản ứng được đọc sau khi nuôi cấy từ 18 – 24 giờ, nếu môi trường được đọc quá sớm, vi sinh vật chỉ có thể lên men đường glucose. Nếu đọc qua muộn, các chất gây men lactose có thể dùng hết lactose và bắt đầu dị hoá pepton, phần nghiêng của môi trường trở lại màu đỏ.
1.5. Môi trường MacConkey Agar
Thạch MacConkey là môi trường chọn lọc cho các vi khuẩn thuộc họ vi khuẩn đường ruột và các trực khuẩn gram âm khác có trong một quần thể hỗn tạp và phân biệt chúng có lên men lactose hay không lên men lactose. Muối mật và tinh thể màu tím ức chế hầu hết các vi sinh vật gram dương nhưng cho phép các trực khuẩn gram âm mọc được. Đường lactose như một nguồn cung cấp carbohydrat duy nhất. Trực khuẩn gram âm, nếu lên men lactose sẽ sinh ra khuẩn lạc màu hồng hoặc đỏ. Ngược lại, nếu không lên men lactose thì khuẩn lạc không có màu hoặc khuẩn lạc có màu trong.
Sau khi đã cấy vi khuẩn lên đĩa môi phân lập, đặt vào tủ ấm 350C, thời gian từ 18 – 24 giờ. Vi khuẩn có thể lên men lactose mạnh hoặc yếu, sau 24 giờ nuôi cấy sinh ra những khuẩn lạc có màu hoặc xuất hiện màu hồng nhẹ sau 24 – 48 giờ. Không nuôi cấy kéo dài quá 48 giờ, như thế có thể làm đảo lộn kết quả.
Thạch MacConkey Sorbitol, có chứa các thành phần giống như thạch MacConkey thông thường khác nhưng có thêm D-sorbitol. Môi trường này được dùng cho phân lập E.coli O157:H7.
1.6. Môi trường Mueller-Hinton Agar
Môi trường thạch Mueller-Hinton Agar là môi trường trong, dùng cho thử nghiệm tính nhạy cảm của vi sinh vật với kháng sinh. Môi trường cũng thường được dùng để thử nghiệm sự thuỷ phân tinh bột. Thạch Mueller-Hinton có chứa hỗn dịch động vật, casamino acid và tinh bột giúp cho hầu hết các vi sinh vật phát triển. Hơn nữa, có thể cho thêm máu cừu vào công thức cơ bản để thực hiện thử nghiệm tính nhạy cảm của chủng Streptococci. Khi đun nóng máu cừu tạo thành chocolate với thạch Mueller-Hinton thì có thể thử nghiệm với các vi sinh vật khó mọc, như Heamophilus và Neisseria.
1.7. Môi trường dinh dưỡng (Nutrient Agar)
Môi trường thạch dinh dưỡng được sử dụng để phân biệt giữa một số ít loài Neisseria dễ mọc với các loài Neisseria khác, như N.gonorrhoeae và N.meningitidis. Số ít loài Neisseriae dễ mọc thì phát triển được trên môi trường thạch dinh dưỡng, ngược lại có nhiều loài không phát triển được. Thạch dinh dưỡng cũng thường được dùng làm môi trường lưu giữ chủng. Thạch dinh dưỡng có chứa các chất dinh dưỡng động vật và đặc biệt là hàm lượng protein thấp. Chủng phân lập nào phát triển được trên môi trường này thì cũng có nghĩa là chủng đó rất dễ mọc và không đòi hỏi bất cứ thành phần đặc biệt nào.
1.8. Môi trường Oxydative-Fermentative (OF)
Môi trường thạch Oxydative-Fermentative hoặc OF là môi trường luôn được dùng để xác định cách sử dụng carbonhydrat của vi sinh vật là kiểu oxy hoá, lên men hoặc trơ. Đây là môi trường rất quan trọng để định danh các trực khuẩn gram âm không lên men đường glucose như: Pseudomonas, Acinetobacter spp .
Môi trường có chứa một lượng nhỏ pepton để ngăn cản sự tạo thành sản phẩm kiềm, vì các sản phẩm này có thể trung hoà một lượng nhỏ sản phẩm acid qua quá trình oxy hoá. Lượng lớn carbonhydrat trong môi trường đã làm tăng số lượng acid mà nó có thể tạo thành. Môi trường cũng có lượng nhỏ thạch để tạo cho môi trường không rắn cũng không lỏng, tạo điều kiện cho phép acid tạo thành trên bề mặt và khuếch tán qua môi trường. Màu xanh bromthymol như chỉ thị màu pH để phát hiện acid.
1.9. Môi trường thử nghiệm tính di động
Mục đích của môi trường thử tính di động là để xác định một vi khuẩn có thể di động được hay không. Đây là thử nghiệm đặc biệt dùng cho định danh các thành viên của họ vi khuẩn đường ruột, thường cho 2 loại Shigella và Klebsiella luôn không di động, và các loài Yersinia chắc chắn di động ở nhiệt độ phòng nhưng không di động ở 350C.
Các vi khuẩn không di động là do không có lông roi, chỉ phát triển ở trong đường cấy và xung quanh môi trường trong. Các vi sinh vật di động, đã sử dụng lông roi để di chuyển ra ngoài của đường cấy và xuất hiện mờ khói trong môi trường. Lượng thạch trong môi trường thấp làm cho môi trường không lỏng, không cứng để cho phép phát hiện di động tốt nhất.
Dùng đầu que cấy chọc thẳng vào môi trường, thận trong di chuyển đầu que cấy trên 1 đường, không chọc que cấy xuông tận đáy tupe. Ủ môi trường nuôi cấy ở 350C. Bản chất lông roi là protein, do vậy không tạo thành tốt ở nhiệt độ cao, một số nhà sinh vật học thích ủ ở nhiệt độ từ 18 – 200C.
1. 10. Môi trường thạch Salmonella- Shigella (SS Agar)
Thạch Salmonella- Shigella thường dùng để chọn lọc Salmonella và một vài chủng Shigella từ mẫu xét nghiệm phân. Những vi sinh vật này được phân biệt trên môi trường thạch SS bằng đặc điểm khuẩn lạc trên môi trường. Thành phần môi trường SS có chứa muối mật, natri citrate và xanh brillian, để ức chế các trực khuẩn gram dương và rất nhiều trực khuẩn lên men đường lactose thông thường khác tìm thấy trong phân. Nếu một vi sinh vật phát triển trên môi trường và lên men lactose, thì nó sẽ sinh ra acid và thay đổi thành màu đỏ - hồng. Nếu thiosulfate natri tham gia vào như một nguồn sulfur cho quá trình sinh ra hydrogen sulfid. Nếu hydrogen sulfid hiện diện trong môi trường thì sẽ tạo thành chất kết tủa màu đen ở giữa khuẩn lạc.
Khuẩn lạc Shigella xuất hiện không màu trên môi trường SS, vì những vi sinh vật này không lên men đường lactose hoặc sinh hydrogen sulfid. Khuẩn lạc Salmonella không màu và có điểm đen ở giữa khuẩn lạc, vì vi khuẩn này to lên hydrogen sulfid nhưng không lên men đường lactose. Khuẩn lạc chuyển từ màu hồng đến màu đỏ cho thấy sinh vật lên men đường lactose, nếu có màu đen ở giữa thì đó cũng sinh ra hydrogen sulfid. Nếu Proteus phát triển trên môi trường này thì khả năng tạo thành những đám sẽ bị hạn chế.
1. 11. Môi trường Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose (TCBS)
Môi trường thạch Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose là môi trường chọn lọc dùng để phân lập các loài Vibrio từ mẫu xét nghiệm phân có lẫn với vi khuẩn chí khác. Các loài Vibrio được phân biệt bằng đặc điểm do khuẩn lạc sinh ra trên môi trường. Các kiểu khuẩn lạc khác nhau được sinh ra từ các loài Vibrio khác nhau, thể hiện qua sự lên men của sucrose. Ví dụ: V.cholerae và V. alginolyticus sinh ra các khuẩn lạc màu vàng, vì chúng lên men đường sucrose, ngược lại V. parahaemolyticus và V.vulniticus luôn sinh ra khuẩn lạc màu xanh do thiếu lên men sucrose. Vi sinh vật Vibrio không sinh ra hydrogen sulfid.
Khi dùng thạch TCBS, chúng ta nên dùng chất nuôi cấy đặc, những loài Vibrio dễ chết đột ngột và môi trường này có để ngăn chặn được điều đó. Mẫu xét nghiệm tươi là tốt nhất, vì vi sinh vật này nhạy cảm với điều kiện khô, ánh sáng và pH acid. Nếu xử lý chậm thì nên sử dụng môi trường Cary-Blair để vận chuyển bệnh phẩm tốt hơn là môi trường vận chuyển có đệm glycerol. Đĩa môi trường nuôi cấy nên ủ ở nhiệt độ 350C, thời gian từ 18 – 24 giờ, dài nhất là 48 giờ. Không lấy khuẩn lạc ở môi trường TCBS để làm thử nghiệm oxydase.
1.12. Môi trường Esculin Agar
Môi trường thạch esculin là môi trường phân biệt khả năng thủy phân esculin của vi khuẩn. Những sản phẩm thuỷ phân từ phản ứng esculin với muối sắt có trong môi trường gây ra kết tủa các thành phần iron, và sản phẩm của sự kết tủa đó làm đổi màu của môi trường từ màu xám tới màu đen. Cấy vi khuẩn lên phần nghiêng của môi trường, ủ ở 350C trong điều kiện hiếu khí và quan sát sự phát triển, môi trường có màu đen cho thấy có sự thủy phân esculin.
1.13. Môi trường Methyl Red-Voges-Proskauer (MR-VP)
Môi trường canh thang MRVP dùng cho các thử nghiệm đỏ methyl và Voges-Proskauer. Quy trình này dùng để phân biệt các thành viên thuộc họ Enterobacteriaceae (họ vi khuẩn đường ruột), ví dụ: E.coli, đỏ methyl dương và Voges-Proskauer âm; Enterobacter aerogene và Klebsiella pneumoniae cho các phản ứng ngược lại. Các thành viên thuộc họ vi khuẩn đường ruột được chia thành 2 nhóm dựa trên cách chuyển hoá đường glucose. Một nhóm sản sinh ra một lượng lớn hỗn hợp acid (lactic, formic, succinic, acetic). Khi cho thuốc thử đỏ methyl vào một trong các vi khuẩn thuộc nhóm này, màu đỏ xuất hiện do pH có tính acid. Nhóm thứ 2 sản sinh chủ yếu các sản phẩm trung tính, acetoin hoặc acetyl-methylcarbinol.
Thử nghiệm đỏ methyl, canh khuẩn phải được ủ ấm 48 giờ. Lấy vào mỗi ống nghiệm 0,5 đến 1 ml canh khuẩn, ủ 350C, thời gian 18 – 24 giờ là có thể thực hiện được thử nghiệm. Trong quá trình thử nghiệm, lắc ống nghiệm để canh khuẩn hấp thụ oxy và tăng thêm phản ứng.
1.14. Môi trường Blood Agar
Môi trường thạch máu (Blood Agar) là môi trường thường xuyên dùng để nuôi cấy các vi khuẩn không khó mọc lắm. Môi trường được pha chế hoặc thạch triptic soy cơ bản được làm giầu thêm bằng cách thêm 5 – 10% máu cừu, máu thỏ hoặc máu người đã phá vỡ sợi fibrin. Sự kết hợp của máu không chỉ cung cấp chất dinh dưỡng cho vi khuẩn phát triển mà còn cho phép phát hiện đặc tính tan máu của vi khuẩn.
1.15. Môi trường Mannitol Sald Agar
Môi trường thạch Mannitol là môi trường nuôi cấy chọn lọc cơ bản dùng để tăng sinh và định danh Staphylococci từ mẫu xét nghiệm có lẫn với vi khuẩn chí khác. Đậm độ muối cao (7,5%) có tác dụng ức chế hầu hết vi khuẩn gram âm và gram dương trừ Staphylococcus spp. Vi khuẩn Staphylococcus aureus có khả năng lên men đường mannitol, sinh ra sản phẩm acid làm pH của môi trường giảm, phenol từ màu đỏ chuyển sang màu vàng, khuẩn lạc điển hình của Staphylococcus aureus xuất hiện màu vàng. Những loài Staphylococcus và Micrococcus khác thường không lên men đường mannitol, do đó sinh ra khuẩn lạc màu hơi đỏ.
Sau khi cấy vi khuẩn lên đĩa môi trường, ủ ấm 350C trong khí trường không có CO2, thời gian 24 – 48 giờ. Một số chủng Staphylococcus aureus có thể lên men đường mannitol chậm, do vậy không nên loại bỏ môi trường đã nuôi cấy trong vòng 48 giờ. Các chủng nghĩ đến là S.aureus cần được làm thêm các thử nghiệm như coagulase hoặc bằng một thường quy chuẩn khác.
1.16. Môi trường Selenite F
Canh thang Selenite F là môi trường tăng sinh cho số ít thành viên của Salmonella và một vài chủng Shigella từ phân và mẫu xét nghiệm chứa số lượng lớn vi sinh vật ô hợp. Môi trường có Selenite natri đã ức chế rất nhiều trực khuẩn gram âm và cầu khuẩn đường ruột (Enterococci) nhưng cho phép tăng sinh Salmonella và một vài loài Shigella. Selenite hiệu quả nhất là trung hoà pH, trong quá trình phát triển của vi khuẩn đã làm giảm Selenite, các sản phẩm kiềm hoá đã được sinh ra, cho nên đường lactose cũng có trong môi trường này. Các chất lên men đường lactose sinh ra acid, và các sản phẩm kiềm được trung hoà và trở lại môi trường để trung hoà pH.
1.17. Môi trường Thayer-Martin, Modified (MTM)
Thạch Modified Thayer-Martin là môi trường giầu dinh dưỡng dùng để tăng sinh Neisseria gonorrhoeae và N. meningitidis từ mẫu xét nghiệm có các vi khuẩn chí ô hợp. Môi trường thạch Modified Thayer-Martin giầu dinh dưỡng, do vậy nhiều loài Neisseria khó mọc cũng có thể phát triển được. Môi trường có các yếu tố phát triển như hemoglobin, vitamin, cocarboxylase, diphosphopyridin nucleotid và glutamin.
Công thức của Modified chứa nhiều thạch để ngăn chặn sự lan toả của proteus. Thạch Modified Thayer-Martin có chứa một số kháng thể, ức chế vi khuẩn chí thông thường và ngăn chặn sự phát triển của hầu hết các vi khuẩn như vancomycin ức chế cầu khuẩn gram dương phát triển, colistin ức chể trực khuẩn gram âm và nistatin ngăn chặn sự phát triển của nấm. Đĩa môi trường MTM sau khi đã cấy vi khuẩn, được ủ ấm trong khí trường có CO2 hoặc bình nến trong vài ngày.
1.18. Môi trường Peptone-Yeast Extract-Glucose (PYG)
Canh thang Peptone-Yeast Extract-Glucose là môi trường được dùng cho nuôi cấy vi khuẩn. Có thể dùng thường quy ghi sắc ký lỏng để phát hiện các sản phẩm chuyển hoá cuối cùng trong canh cấy PYG phân lập vi khuẩn kỵ khí. Canh thang PYG có chưa một số chất dinh dưỡng và thành phần bổ sung để kích thích vi khuẩn kỵ khí phát triển. Thành phần dinh dưỡng gồm vitamin K (cho sinh sắc tố Prevotella và Porphyromonas), cao men, hemin và glucose. Chất Resazurin đáp ứng như chất chỉ thị vi khuẩn kỵ khí. Khi môi trường xuất hiện màu hồng nghĩa là có hiện diện của oxy.
1.19. Môi trường Lowenstein-Jensen (LJ)
Môi trường Lowenstein-Jensenđược dùng để nuôi cấy Mycobacterium spp. Trong môi trường hầu hết có chứa thành phần có thể ức chế sự phát triển của Mycobacteria. Bột khoai tây, trứng và glycerol có trong môi trường LJ có tác dụng giúp khử độc môi trường này, đồng thời cung cấp chất dinh dưỡng cho vi khuẩn này phát triển. Môi trường LJ đảm bảo tốt trong 1 tháng nếu vặn chặt nắp, để nơi khô ráo và nhiệt độ từ 4 – 60C. Môi trường LJ cũng phải được giữ ở nơi tối, vì xanh malachite rất nhạy với ánh sáng. Bệnh phẩm đã được nuôi cấy lên môi trường, ủ ấm trong khí trường CO2 (5 – 10%), từ 6 – 10 tuần. Một điều quan trọng là phải nới lỏng nắp để cho thay đổi không khí bên trong.
2. CÁC THỬ NGHIỆM TRÊN MÔI TRƯỜNG THÔNG THƯỜNG
Môi trường nuôi cấy có thể được chuẩn bị từ những thành phần riêng hoặc chuẩn bị từ môi trường dưới dạng bột khô đã được thương mại hoá. Ngày nay, môi trường dạng bột khô được thương mại hoá đã trở lên phổ biến tại các phòng thí nghiệm vi khuẩn lâm sàng. Một số điểm quan trọng để kiểm soát chất lượng của môi trường như sau:
- Không dùng môi trường đã hết hạn sử dụng;
- Hộp môi trường cần được vặn chặt bằng nắp để tránh ẩm;
- Giữ môi trường vào nơi tối, thoáng khí, mát;
- Không sử dụng môi trường dạng bột khô đã bị ngả màu hoặc vón cục. Thường xuyên đảo môi trường dự trữ theo nguyên tắc: ngoài vào, trong ra.
- Khi chuẩn bị môi trường cần phải tuân thủ nghiêm ngặt chỉ dẫn của nhà sản xuất.
- Không để môi trường đã được pha chế ở ngoài ánh sáng và nhiệt độ phòng.
- Kiểm tra độ tiệt trùng và pH của môi trường đã chuẩn bị.
---------- bổ sung bài viết ----------
Bảng 1. Các thử nghiệm trên một số môi trường thường dùng
Bảng 2. Giám sát chất lượng của các thử nghiệm thường dùng
Lưu ý: các thử nghiệm kiểm tra chất lượng phải được thực hiện cho mỗi lần pha mới dung dịch.
Trong phòng thí nghiệm y tế, để phân lập và định danh vi khuẩn gây bệnh cần phải sử dụng đến nhiều loại môi trường nuôi cấy và hoá chất thích hợp cho một số thử nghiệm, đặc biệt là thử nghiệm sinh hoá. Bên cạnh đó, việc đánh giá chất lượng pha chế môi trường đúng quy cách cũng là một trong những khâu quan trọng trong công tác xét nghiệm vi khuẩn.
Cho đến nay, có nhiều loại môi trường khác nhau được dùng cho phân lập và định danh vi khuẩn, và thường được xếp thành 3 loại chủ yếu là: môi trường nuôi cấy cơ bản, môi trường tăng sinh vi khuẩn (có giầu chất dinh dưỡng) và môi trường nuôi cấy chọn lọc. Mỗi loại môi trường sẽ được sử dụng với những mục đích khác nhau trong nuôi cấy, phân lập và định danh vi sinh vật có trong mẫu xét nghiệm của bệnh nhân.
1. MỘT SỐ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY THÔNG THƯỜNG
1.1. Môi trường Chocolate agar
Môi trường thạch chocolate là môi trường giầu dinh dưỡng và thường được dùng cho vi khuẩn Haemophilus, S.pneumoniae và các loài vi khuẩn khó phát triển khác. Đây là môi trường thạch máu cừu, khi thêm máu cừu vào môi trường cơ bản trong điều kiện nhiệt độ đủ để giải phóng tế bào hồng cầu và nicotinamid - adenin dinucleotid (NAD). Môi trường đổ đĩa được bảo quản ở 40C. Đĩa môi trường đã cấy bệnh phẩm được ủ ấm ở nhiệt độ 350C trong khí trường có 5% CO2, thời gian 18 – 24 giờ, quan sát sự phát triển của vi khuẩn.
1.2. Môi trường Simmons citrate
Môi trường thạch Cimmons citrate được sử dụng cho các trực khuẩn đường ruột gram âm khác nhau. Giống như nguyên lý sử dụng môi trường acetat của vi khuẩn, để phân biệt các loại vi khuẩn người ta dựa vào sự khác biệt do khả năng sử dụng citrate như là nguồn carbon duy nhất của chủng phân lập. Môi trường có pH khoảng 6,9. Ống môi trường sau khi cấy huyền dịch vi khuẩn lên mặt nghiêng, để tủ ấm 35oC, quan sát sự thay đổi trong 4 ngày.
1.3. Môi trường Deoxychocolate citrate
Thạch Deoxychocolate citrate là môi trường chọn lọc, môi trường khác nhau dùng cho phân lập trực tiếp các căn nguyên gây bệnh đường ruột từ phân và bệnh phẩm nước tiểu hoặc gián tiếp từ canh thang giầu dinh dưỡng như selenite-F. Các thành phần chọn lọc có trong môi trường như citrate natri và deoxycholate natri đã phối hợp với nhau để ức chế các trực khuẩn đường ruột khác mà không phải là căn nguyên gây bệnh nguy hiểm.
Thành phần khác nhau ở đây là lactose, căn nguyên gây bệnh đường ruột không lên men đường sẽ xuất hiện các khuẩn lạc không màu. Nếu lên men đường lactose, xuất hiện những khuẩn lạc chuyển từ màu hồng sang màu đỏ, đó là kết quả của sự thay đổi pH trong quá trình lên men đường lactose.
Cấy khuẩn lạc lên môi trường đổ đĩa, ủ ấm 350C/48 giờ. Chất nuôi cấy mà nhiều như mẫu phân, nước tiểu, hoặc các chất khác của cơ thể thì có thể cấy trực tiếp vào môi trường, ngược lại nếu chất nuôi cấy ít thì nên làm thêm một bước là cấy vào môi trường tăng sinh trước rồi mới cấy vào môi trường chọn lọc.
1.4. Môi trường Kligler Iron Agar (KIA)
Môi trường thạch Kligler Iron Agar được sử dụng để nuôi cấy trực tiếp cho trực khuẩn gram âm lên men đường glucose, đây là đặc điểm cơ bản trong phân loại bước đầu của các trực khuẩn gram âm. Môi trường này cũng đồng thời thử tính lên men đường lactose, sinh hơi trong quá trình lên men carbohydrat và sinh H2S. Tất cả những đặc điểm đó đã được sử dụng cho các trực khuẩn gram âm thuộc họ vi khuẩn đường ruột.
Môi trường KIA gồm glucose và lactose (có thể lên men carbohydrat), đỏ phenol (chỉ thị pH), pepton (nguồn carbon/nitrogen) và muối sắt cộng với thiosulfate natri. Có 3 hình thái lên men carbohydrat có thể xảy ra là:
- Acid (màu vàng) phần gốc và kiềm (màu đỏ) phần nghiêng của môi trường, khi đó cho thấy vi sinh vật lên men đường glucose nhưng không lên men đường lactose.
- Acid (màu vàng) phần gốc và acid (màu vàng) phần nghiêng của môi trường, khi đó cho thấy vi sinh vật lên men cả đường glucose và đường lactose.
- Kiềm (màu đỏ) phần gốc và kiềm (màu đỏ) phần nghiêng môi trường, khi đó cho thấy vi sinh vật không thể lên men đường glucose và đường lactose. Các sản phẩm sinh ra không phải là sản phẩm acid.
Nếu sinh hơi, có hơi ở phần gốc của ống môi trường, môi trường bị chia cắt hoặc đẩy môi trường lên khỏi đáy ống. Nếu thấy màu đen ở phần gốc ống, vi sinh vật đã sinh ra hydrogen sulfid gas từ thiosulfid. Phản ứng được đọc sau khi nuôi cấy từ 18 – 24 giờ, nếu môi trường được đọc quá sớm, vi sinh vật chỉ có thể lên men đường glucose. Nếu đọc qua muộn, các chất gây men lactose có thể dùng hết lactose và bắt đầu dị hoá pepton, phần nghiêng của môi trường trở lại màu đỏ.
1.5. Môi trường MacConkey Agar
Thạch MacConkey là môi trường chọn lọc cho các vi khuẩn thuộc họ vi khuẩn đường ruột và các trực khuẩn gram âm khác có trong một quần thể hỗn tạp và phân biệt chúng có lên men lactose hay không lên men lactose. Muối mật và tinh thể màu tím ức chế hầu hết các vi sinh vật gram dương nhưng cho phép các trực khuẩn gram âm mọc được. Đường lactose như một nguồn cung cấp carbohydrat duy nhất. Trực khuẩn gram âm, nếu lên men lactose sẽ sinh ra khuẩn lạc màu hồng hoặc đỏ. Ngược lại, nếu không lên men lactose thì khuẩn lạc không có màu hoặc khuẩn lạc có màu trong.
Sau khi đã cấy vi khuẩn lên đĩa môi phân lập, đặt vào tủ ấm 350C, thời gian từ 18 – 24 giờ. Vi khuẩn có thể lên men lactose mạnh hoặc yếu, sau 24 giờ nuôi cấy sinh ra những khuẩn lạc có màu hoặc xuất hiện màu hồng nhẹ sau 24 – 48 giờ. Không nuôi cấy kéo dài quá 48 giờ, như thế có thể làm đảo lộn kết quả.
Thạch MacConkey Sorbitol, có chứa các thành phần giống như thạch MacConkey thông thường khác nhưng có thêm D-sorbitol. Môi trường này được dùng cho phân lập E.coli O157:H7.
1.6. Môi trường Mueller-Hinton Agar
Môi trường thạch Mueller-Hinton Agar là môi trường trong, dùng cho thử nghiệm tính nhạy cảm của vi sinh vật với kháng sinh. Môi trường cũng thường được dùng để thử nghiệm sự thuỷ phân tinh bột. Thạch Mueller-Hinton có chứa hỗn dịch động vật, casamino acid và tinh bột giúp cho hầu hết các vi sinh vật phát triển. Hơn nữa, có thể cho thêm máu cừu vào công thức cơ bản để thực hiện thử nghiệm tính nhạy cảm của chủng Streptococci. Khi đun nóng máu cừu tạo thành chocolate với thạch Mueller-Hinton thì có thể thử nghiệm với các vi sinh vật khó mọc, như Heamophilus và Neisseria.
1.7. Môi trường dinh dưỡng (Nutrient Agar)
Môi trường thạch dinh dưỡng được sử dụng để phân biệt giữa một số ít loài Neisseria dễ mọc với các loài Neisseria khác, như N.gonorrhoeae và N.meningitidis. Số ít loài Neisseriae dễ mọc thì phát triển được trên môi trường thạch dinh dưỡng, ngược lại có nhiều loài không phát triển được. Thạch dinh dưỡng cũng thường được dùng làm môi trường lưu giữ chủng. Thạch dinh dưỡng có chứa các chất dinh dưỡng động vật và đặc biệt là hàm lượng protein thấp. Chủng phân lập nào phát triển được trên môi trường này thì cũng có nghĩa là chủng đó rất dễ mọc và không đòi hỏi bất cứ thành phần đặc biệt nào.
1.8. Môi trường Oxydative-Fermentative (OF)
Môi trường thạch Oxydative-Fermentative hoặc OF là môi trường luôn được dùng để xác định cách sử dụng carbonhydrat của vi sinh vật là kiểu oxy hoá, lên men hoặc trơ. Đây là môi trường rất quan trọng để định danh các trực khuẩn gram âm không lên men đường glucose như: Pseudomonas, Acinetobacter spp .
Môi trường có chứa một lượng nhỏ pepton để ngăn cản sự tạo thành sản phẩm kiềm, vì các sản phẩm này có thể trung hoà một lượng nhỏ sản phẩm acid qua quá trình oxy hoá. Lượng lớn carbonhydrat trong môi trường đã làm tăng số lượng acid mà nó có thể tạo thành. Môi trường cũng có lượng nhỏ thạch để tạo cho môi trường không rắn cũng không lỏng, tạo điều kiện cho phép acid tạo thành trên bề mặt và khuếch tán qua môi trường. Màu xanh bromthymol như chỉ thị màu pH để phát hiện acid.
1.9. Môi trường thử nghiệm tính di động
Mục đích của môi trường thử tính di động là để xác định một vi khuẩn có thể di động được hay không. Đây là thử nghiệm đặc biệt dùng cho định danh các thành viên của họ vi khuẩn đường ruột, thường cho 2 loại Shigella và Klebsiella luôn không di động, và các loài Yersinia chắc chắn di động ở nhiệt độ phòng nhưng không di động ở 350C.
Các vi khuẩn không di động là do không có lông roi, chỉ phát triển ở trong đường cấy và xung quanh môi trường trong. Các vi sinh vật di động, đã sử dụng lông roi để di chuyển ra ngoài của đường cấy và xuất hiện mờ khói trong môi trường. Lượng thạch trong môi trường thấp làm cho môi trường không lỏng, không cứng để cho phép phát hiện di động tốt nhất.
Dùng đầu que cấy chọc thẳng vào môi trường, thận trong di chuyển đầu que cấy trên 1 đường, không chọc que cấy xuông tận đáy tupe. Ủ môi trường nuôi cấy ở 350C. Bản chất lông roi là protein, do vậy không tạo thành tốt ở nhiệt độ cao, một số nhà sinh vật học thích ủ ở nhiệt độ từ 18 – 200C.
1. 10. Môi trường thạch Salmonella- Shigella (SS Agar)
Thạch Salmonella- Shigella thường dùng để chọn lọc Salmonella và một vài chủng Shigella từ mẫu xét nghiệm phân. Những vi sinh vật này được phân biệt trên môi trường thạch SS bằng đặc điểm khuẩn lạc trên môi trường. Thành phần môi trường SS có chứa muối mật, natri citrate và xanh brillian, để ức chế các trực khuẩn gram dương và rất nhiều trực khuẩn lên men đường lactose thông thường khác tìm thấy trong phân. Nếu một vi sinh vật phát triển trên môi trường và lên men lactose, thì nó sẽ sinh ra acid và thay đổi thành màu đỏ - hồng. Nếu thiosulfate natri tham gia vào như một nguồn sulfur cho quá trình sinh ra hydrogen sulfid. Nếu hydrogen sulfid hiện diện trong môi trường thì sẽ tạo thành chất kết tủa màu đen ở giữa khuẩn lạc.
Khuẩn lạc Shigella xuất hiện không màu trên môi trường SS, vì những vi sinh vật này không lên men đường lactose hoặc sinh hydrogen sulfid. Khuẩn lạc Salmonella không màu và có điểm đen ở giữa khuẩn lạc, vì vi khuẩn này to lên hydrogen sulfid nhưng không lên men đường lactose. Khuẩn lạc chuyển từ màu hồng đến màu đỏ cho thấy sinh vật lên men đường lactose, nếu có màu đen ở giữa thì đó cũng sinh ra hydrogen sulfid. Nếu Proteus phát triển trên môi trường này thì khả năng tạo thành những đám sẽ bị hạn chế.
1. 11. Môi trường Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose (TCBS)
Môi trường thạch Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose là môi trường chọn lọc dùng để phân lập các loài Vibrio từ mẫu xét nghiệm phân có lẫn với vi khuẩn chí khác. Các loài Vibrio được phân biệt bằng đặc điểm do khuẩn lạc sinh ra trên môi trường. Các kiểu khuẩn lạc khác nhau được sinh ra từ các loài Vibrio khác nhau, thể hiện qua sự lên men của sucrose. Ví dụ: V.cholerae và V. alginolyticus sinh ra các khuẩn lạc màu vàng, vì chúng lên men đường sucrose, ngược lại V. parahaemolyticus và V.vulniticus luôn sinh ra khuẩn lạc màu xanh do thiếu lên men sucrose. Vi sinh vật Vibrio không sinh ra hydrogen sulfid.
Khi dùng thạch TCBS, chúng ta nên dùng chất nuôi cấy đặc, những loài Vibrio dễ chết đột ngột và môi trường này có để ngăn chặn được điều đó. Mẫu xét nghiệm tươi là tốt nhất, vì vi sinh vật này nhạy cảm với điều kiện khô, ánh sáng và pH acid. Nếu xử lý chậm thì nên sử dụng môi trường Cary-Blair để vận chuyển bệnh phẩm tốt hơn là môi trường vận chuyển có đệm glycerol. Đĩa môi trường nuôi cấy nên ủ ở nhiệt độ 350C, thời gian từ 18 – 24 giờ, dài nhất là 48 giờ. Không lấy khuẩn lạc ở môi trường TCBS để làm thử nghiệm oxydase.
1.12. Môi trường Esculin Agar
Môi trường thạch esculin là môi trường phân biệt khả năng thủy phân esculin của vi khuẩn. Những sản phẩm thuỷ phân từ phản ứng esculin với muối sắt có trong môi trường gây ra kết tủa các thành phần iron, và sản phẩm của sự kết tủa đó làm đổi màu của môi trường từ màu xám tới màu đen. Cấy vi khuẩn lên phần nghiêng của môi trường, ủ ở 350C trong điều kiện hiếu khí và quan sát sự phát triển, môi trường có màu đen cho thấy có sự thủy phân esculin.
1.13. Môi trường Methyl Red-Voges-Proskauer (MR-VP)
Môi trường canh thang MRVP dùng cho các thử nghiệm đỏ methyl và Voges-Proskauer. Quy trình này dùng để phân biệt các thành viên thuộc họ Enterobacteriaceae (họ vi khuẩn đường ruột), ví dụ: E.coli, đỏ methyl dương và Voges-Proskauer âm; Enterobacter aerogene và Klebsiella pneumoniae cho các phản ứng ngược lại. Các thành viên thuộc họ vi khuẩn đường ruột được chia thành 2 nhóm dựa trên cách chuyển hoá đường glucose. Một nhóm sản sinh ra một lượng lớn hỗn hợp acid (lactic, formic, succinic, acetic). Khi cho thuốc thử đỏ methyl vào một trong các vi khuẩn thuộc nhóm này, màu đỏ xuất hiện do pH có tính acid. Nhóm thứ 2 sản sinh chủ yếu các sản phẩm trung tính, acetoin hoặc acetyl-methylcarbinol.
Thử nghiệm đỏ methyl, canh khuẩn phải được ủ ấm 48 giờ. Lấy vào mỗi ống nghiệm 0,5 đến 1 ml canh khuẩn, ủ 350C, thời gian 18 – 24 giờ là có thể thực hiện được thử nghiệm. Trong quá trình thử nghiệm, lắc ống nghiệm để canh khuẩn hấp thụ oxy và tăng thêm phản ứng.
1.14. Môi trường Blood Agar
Môi trường thạch máu (Blood Agar) là môi trường thường xuyên dùng để nuôi cấy các vi khuẩn không khó mọc lắm. Môi trường được pha chế hoặc thạch triptic soy cơ bản được làm giầu thêm bằng cách thêm 5 – 10% máu cừu, máu thỏ hoặc máu người đã phá vỡ sợi fibrin. Sự kết hợp của máu không chỉ cung cấp chất dinh dưỡng cho vi khuẩn phát triển mà còn cho phép phát hiện đặc tính tan máu của vi khuẩn.
1.15. Môi trường Mannitol Sald Agar
Môi trường thạch Mannitol là môi trường nuôi cấy chọn lọc cơ bản dùng để tăng sinh và định danh Staphylococci từ mẫu xét nghiệm có lẫn với vi khuẩn chí khác. Đậm độ muối cao (7,5%) có tác dụng ức chế hầu hết vi khuẩn gram âm và gram dương trừ Staphylococcus spp. Vi khuẩn Staphylococcus aureus có khả năng lên men đường mannitol, sinh ra sản phẩm acid làm pH của môi trường giảm, phenol từ màu đỏ chuyển sang màu vàng, khuẩn lạc điển hình của Staphylococcus aureus xuất hiện màu vàng. Những loài Staphylococcus và Micrococcus khác thường không lên men đường mannitol, do đó sinh ra khuẩn lạc màu hơi đỏ.
Sau khi cấy vi khuẩn lên đĩa môi trường, ủ ấm 350C trong khí trường không có CO2, thời gian 24 – 48 giờ. Một số chủng Staphylococcus aureus có thể lên men đường mannitol chậm, do vậy không nên loại bỏ môi trường đã nuôi cấy trong vòng 48 giờ. Các chủng nghĩ đến là S.aureus cần được làm thêm các thử nghiệm như coagulase hoặc bằng một thường quy chuẩn khác.
1.16. Môi trường Selenite F
Canh thang Selenite F là môi trường tăng sinh cho số ít thành viên của Salmonella và một vài chủng Shigella từ phân và mẫu xét nghiệm chứa số lượng lớn vi sinh vật ô hợp. Môi trường có Selenite natri đã ức chế rất nhiều trực khuẩn gram âm và cầu khuẩn đường ruột (Enterococci) nhưng cho phép tăng sinh Salmonella và một vài loài Shigella. Selenite hiệu quả nhất là trung hoà pH, trong quá trình phát triển của vi khuẩn đã làm giảm Selenite, các sản phẩm kiềm hoá đã được sinh ra, cho nên đường lactose cũng có trong môi trường này. Các chất lên men đường lactose sinh ra acid, và các sản phẩm kiềm được trung hoà và trở lại môi trường để trung hoà pH.
1.17. Môi trường Thayer-Martin, Modified (MTM)
Thạch Modified Thayer-Martin là môi trường giầu dinh dưỡng dùng để tăng sinh Neisseria gonorrhoeae và N. meningitidis từ mẫu xét nghiệm có các vi khuẩn chí ô hợp. Môi trường thạch Modified Thayer-Martin giầu dinh dưỡng, do vậy nhiều loài Neisseria khó mọc cũng có thể phát triển được. Môi trường có các yếu tố phát triển như hemoglobin, vitamin, cocarboxylase, diphosphopyridin nucleotid và glutamin.
Công thức của Modified chứa nhiều thạch để ngăn chặn sự lan toả của proteus. Thạch Modified Thayer-Martin có chứa một số kháng thể, ức chế vi khuẩn chí thông thường và ngăn chặn sự phát triển của hầu hết các vi khuẩn như vancomycin ức chế cầu khuẩn gram dương phát triển, colistin ức chể trực khuẩn gram âm và nistatin ngăn chặn sự phát triển của nấm. Đĩa môi trường MTM sau khi đã cấy vi khuẩn, được ủ ấm trong khí trường có CO2 hoặc bình nến trong vài ngày.
1.18. Môi trường Peptone-Yeast Extract-Glucose (PYG)
Canh thang Peptone-Yeast Extract-Glucose là môi trường được dùng cho nuôi cấy vi khuẩn. Có thể dùng thường quy ghi sắc ký lỏng để phát hiện các sản phẩm chuyển hoá cuối cùng trong canh cấy PYG phân lập vi khuẩn kỵ khí. Canh thang PYG có chưa một số chất dinh dưỡng và thành phần bổ sung để kích thích vi khuẩn kỵ khí phát triển. Thành phần dinh dưỡng gồm vitamin K (cho sinh sắc tố Prevotella và Porphyromonas), cao men, hemin và glucose. Chất Resazurin đáp ứng như chất chỉ thị vi khuẩn kỵ khí. Khi môi trường xuất hiện màu hồng nghĩa là có hiện diện của oxy.
1.19. Môi trường Lowenstein-Jensen (LJ)
Môi trường Lowenstein-Jensenđược dùng để nuôi cấy Mycobacterium spp. Trong môi trường hầu hết có chứa thành phần có thể ức chế sự phát triển của Mycobacteria. Bột khoai tây, trứng và glycerol có trong môi trường LJ có tác dụng giúp khử độc môi trường này, đồng thời cung cấp chất dinh dưỡng cho vi khuẩn này phát triển. Môi trường LJ đảm bảo tốt trong 1 tháng nếu vặn chặt nắp, để nơi khô ráo và nhiệt độ từ 4 – 60C. Môi trường LJ cũng phải được giữ ở nơi tối, vì xanh malachite rất nhạy với ánh sáng. Bệnh phẩm đã được nuôi cấy lên môi trường, ủ ấm trong khí trường CO2 (5 – 10%), từ 6 – 10 tuần. Một điều quan trọng là phải nới lỏng nắp để cho thay đổi không khí bên trong.
2. CÁC THỬ NGHIỆM TRÊN MÔI TRƯỜNG THÔNG THƯỜNG
Môi trường nuôi cấy có thể được chuẩn bị từ những thành phần riêng hoặc chuẩn bị từ môi trường dưới dạng bột khô đã được thương mại hoá. Ngày nay, môi trường dạng bột khô được thương mại hoá đã trở lên phổ biến tại các phòng thí nghiệm vi khuẩn lâm sàng. Một số điểm quan trọng để kiểm soát chất lượng của môi trường như sau:
- Không dùng môi trường đã hết hạn sử dụng;
- Hộp môi trường cần được vặn chặt bằng nắp để tránh ẩm;
- Giữ môi trường vào nơi tối, thoáng khí, mát;
- Không sử dụng môi trường dạng bột khô đã bị ngả màu hoặc vón cục. Thường xuyên đảo môi trường dự trữ theo nguyên tắc: ngoài vào, trong ra.
- Khi chuẩn bị môi trường cần phải tuân thủ nghiêm ngặt chỉ dẫn của nhà sản xuất.
- Không để môi trường đã được pha chế ở ngoài ánh sáng và nhiệt độ phòng.
- Kiểm tra độ tiệt trùng và pH của môi trường đã chuẩn bị.
---------- bổ sung bài viết ----------
Bảng 1. Các thử nghiệm trên một số môi trường thường dùng
Bảng 2. Giám sát chất lượng của các thử nghiệm thường dùng
Lưu ý: các thử nghiệm kiểm tra chất lượng phải được thực hiện cho mỗi lần pha mới dung dịch.
![[Image: cmd_cult_media_chromogenic.jpg]](http://www.bio-rad.com/webroot/web/images/cdg/products/microbiology/product_detail/global/cmd_cult_media_chromogenic.jpg)
