Đỗ Mạnh Tuấn, Lê Anh Thư.
Nghiệm pháp Coombs là phản ứng ngưng kết nhờ một quá trình miễn dịch, là một phản ứng đặc biệt quan trọng trong miễn dịch huyết học .
Nghiệm pháp Coombs là phản ứng ngưng kết nhờ một quá trình miễn dịch, là một phản ứng đặc biệt quan trọng trong miễn dịch huyết học .
Các hồng cầu được mẫn cảm bởi các kháng thể không có khả năng gây ngưng kết, vẫn có thể ngưng kết được nhờ một số biện pháp như:
- thêm vào trong môi trường phản ứng một chất cao phân tử (nhằm thay đổi hằng số điện môi của môi trường)
- Xử lý các hồng cầu bằng men phân giải protein để bộc lộ và tăng mật độ kháng nguyên trên bề mặt hồng cầu.
- Các hồng cầu đã bị mẫn cảm bởi các kháng thể không gây ngưng kết có thể sẽ ngưng kết lại nhờ kháng thể kháng globulin, gọi là nghiệm pháp Coombs.
I. NGHIỆM PHÁP COOMBS TRỰC TIẾP : xét nghiệm này cho thấy được bằng chứng về hồng cầu đã mẫn cảm trong cơ thể.
Hồng cầu đã bị bao phủ bởi kháng thể hoặc bổ thể, sẽ bị ngưng kết trực tiếp bởi thuốc thử kháng globulin, thử nghiệm này được gọi là nghiệm pháp Coombs trực tiếp, còn gọi là thử nghiệm hồng cầu [1]. Ta có thể sử dụng khi khảo sát về globulin miễn dịch hoặc bổ thể đã gắn trên hồng cầu, trong bốn trường hợp sau:
- Thiếu máu tan máu tự miễn: hồng cầu đã bị cảm nhiễm bởi tự kháng thể.
- Bệnh tan máu ở trẻ sơ sinh : hồng cầu bị cảm nhiễm bởi kháng thể đồng loài loại IgG của mẹ, thường là anti D
- Thiếu máu tan máu miễn dịch – dị ứng : liên quan đến một số thuốc, ví dụ như: pénicilline, rifampicine
- Các tai biến truyền máu: hồng cầu của người cho bất đồng và bị bao phủ bởi kháng thể đồng loài của người nhận.
Khi muốn khảo sát sự có mặt của kháng thể chống hồng cầu có trong huyết tương, phải đưa vào huyết tương đó hồng cầu có kháng nguyên ứng với kháng nguyên mà ta nghiên cứu, sau đó cho kháng globulin. Nếu các hồng cầu được mẫn cảm bởi kháng thể thì chúng sẽ ngưng kết bởi kháng globulin như trong xét nghiệm Coombs trực tiếp.
Sử dụng thử nghiệm này trong 2 trường hợp sau:
a. Tìm kháng thể bất thường [4]: kháng thể kết hợp đặc hiệu với các kháng nguyên trên hồng cầu bị ngưng kết và không kết hợp ở các hồng cầu không bị ngưng kết. Điều này được sử dụng để nghiên cứu huyết tương của những phụ nữ có thai hoặc bệnh nhân đã được truyền máu, để phát hiện các kháng thể lưu hành
Với xét nghiệm hoà hợp trong điều kiện có kháng globulin, với việc đưa vào huyết thanh của bệnh nhân hồng cầu của người cho bất kỳ, nếu hồng cầu không bị ngưng kết ở thì 2 của thử nghiệm, tức là hồng cầu người cho hoà hợp với hồng cầu người nhận. Nếu có ngưng kết là không phù hợp và đơn vị máu này không được truyền cho bệnh nhân. Đây là một kỹ thuật bắt buộc trong xét nghiệm hòa hợp phát máu đã được quy định trong quy chế truyền máu 2007 [3].
b. Để xác định một vài nhóm máu : một số thuốc thử được sử dụng để định nhóm máu chỉ hoạt động với phương pháp này, ví dụ như thuốc thử Anti Fy[sup]a [/sup](định nhóm máu Duffy). [sup] [/sup]Người ta ủ thuốc thử với hồng cầu được xét nghiệm (các hồng cầu này đã được rửa), nếu có Fy[sup]a[/sup], kháng thể sẽ gắn lên và gây ngưng kết ở thì 2.
III. THỬ NGHIỆM COOMBS LÀ MỘT PHẢN ỨNG MIỄN DỊCH HUYẾT HỌC NHIỀU KHẢ NĂNG NHẤT
Các dạng khác nhau của nghiệm pháp Coombs trực tiếp: Coombs đa giá và Coombs đặc hiệu
a. Anti globulin loại đa giá có chứa kháng IgG và kháng các thành phần của bổ thể, xét nghiệm Coombs chính vì vậy cũng là đa giá. Phản ứng dương tính chứng tỏ hồng cầu được phủ bởi globulin miễn dịch hoặc bổ thể, nhưng không phân biệt được 2 yếu tố trên.
b. Ngược lại khi người ta nghi ngờ hồng cầu bị phủ bởi 1 loại globulin miễn dịch, đặc biệt là IgG hoặc chỉ là thành phần bổ thể, khi đó người ta sử dụng thuốc thử kháng globulin đặc hiệu (nghiệm pháp Coombs đặc hiệu: IgG hay bổ thể).
Trong trường hợp tan máu ở trẻ sơ sinh nghiệm pháp Coombs trực tiếp phát hiện trên hồng cầu của trẻ thường là IgG. Ngược lại, với thiếu máu tan máu tự miễn có thể phân biệt được rất nhiều loại: IgG , bổ thể hoặc hỗn hợp, các thông tin này rất có ích cho lâm sàng. Trong trường hợp định một số nhóm máu như nhóm Fy[sup]a[/sup] 4tương ứng với nghiệm pháp Coombs IgG, nhóm Le[sup]a[/sup], Jk[sup]a[/sup] tương ứng với Coombs bổ thể.
IV. NHỮNG KHÓ KHĂN TRONG NGHIỆM PHÁP COOMBS :
Nghiệm pháp Coombs là 1 phản ứng mà trong đó tất cả các yếu tố tham gia đều phải thực hiện rất chuẩn xác: chất lượng và điều kiện bảo quản thuốc thử, chất lượng hồng cầu v.v. Rất nhiều yếu tố ảnh hưởng có thể gây sai lầm cho phản ứng
Một nguyên tắc để kết quả xét nghiệm được chính xác, đó là mẫu máu bệnh nhân phải được tách lấy huyết thanh ngay. Thử nghiệm cần phải được thực hiện trong vòng 2 giờ, mẫu máu xét nghiệm trước khi làm phải được đặt ở 37 độ C để tránh sự cố định của kháng thể tự nhiên vào phức hợp (gây dương tính giả), thử nghiệm Coobms dương tính với hồng cầu để ở 4[sup]o[/sup]C thường không có giá trị.
Chú ý phải làm xét nghiệm chứng trong các quy trình kỹ thuật, để kiểm tra chất lượng thuốc thử và đánh giá được các bất thường hoặc các khó khăn như hiện tượng đa ngưng kết.
Một số trường hợp khó khăn khi tiến hành xét nghiệm:
- Tăng protein: bệnh nhân bị tăng protein hoặc tiềm tàng trong huyết thanh một paraprotein (trong đa u tuỷ xương hoặc Wandestrom) [1].
- Hiện tượng đa ngưng kết: có hai cơ chế
- Sự gắn in vivo của kháng thể đa giá (có hoặc không vai trò của bổ thể), có các immunoglobulin trong huyết thanh Coombs.
c. Sự bất bình thường của màng tế bào: trường hợp đặc biệt, có thể gặp thử nghiệm Coombs dương tính do bất bình thường của màng tế bào, nó hấp phụ không theo cơ chế miễn dịch các protein huyết thanh.
d. Hiệu lực của tế bào sợi võng
e. Các khó khăn để tinh khiết với Coombs bổ thể
- Sự có mặt của hai quần thể hồng cầu
- Thử nghiệm Coombs trực tiếp với trẻ dưới 3 tháng tuổi: do ở đây có sự có mặt của kháng thể của mẹ lưu hành trong huyết thanh con, có thể là kháng thể đồng loài chống D, c, Fy[sup]a[/sup], K, Jk[sup]a[/sup].
5.1. Bệnh tan máu ở trẻ sơ sinh: xét nghiệm Coombs là một xét nghiệm chủ yếu cho phép thấy được sự mẫn cảm của hồng cầu trẻ sơ sinh với kháng thể đồng loài của mẹ.
Trường hợp này phản ứng Coombs trực tiếp dương tính rõ và kháng thể thuộc type IgG. Các bệnh tan máu thường liên quan đến anti D, anti c, anti E, anti Fy [sup]a[/sup], anti Kell, anti S hoặc anti s và anti Jk[sup]a[/sup].
Với bệnh tan máu ở trẻ sơ sinh do bất đồng nhóm máu ABO, phản ứng Coombs trực tiếp tỷ lệ dương tính thường không quá 15 đến 20%. Phản ứng âm tính là do một số vị trí A không đầy đủ, hoặc dị loài. Do vậy ở đây bằng xét nghiệm Coombs để tìm sự có mặt của kháng thể miễn dịch chống A. Tỷ lệ bilirubin huyết thanh ở trẻ sơ sinh có thể giúp nhiều cho lâm sàng.
5.2. Thiếu máu tan máu tự miễn (AHA - anémie hémolytiques auto -immues ) :
a. AHA type IgG hoặc hỗn hợp là một bệnh thường thấy ở người trẻ tuổi, đặc biệt là nữ giới, với biểu hiện tan máu hoặc hồng cầu bị giữ lại ở gan lách, trường hợp này rất nhạy cảm với corticoid liệu pháp. Căn nguyên lâm sàng rất nhiều, trong một nửa số trường hợp không rõ căn nguyên, một số trường hợp có liên quan đến các bệnh tự miễn khác như lupus ban đỏ rải rác, xuất huyết giảm tiểu cầu…Trong các trường hợp này, nhất là với thể hỗn hợp, qua khảo sát miễn dịch có thể thấy các kháng thể liên quan như yếu tố viêm khớp, kháng thể cơ trơn v.v, các kháng thể đồng loài hoặc dị loài (kháng thể chống các kháng nguyên nhóm máu hiếm như Mi[sup]a[/sup], Mg…) với hiệu giá cao .
b. AHA loại bổ thể đơn thuần hoặc có ngưng kết tố lạnh: có thể tồn tại một cách tự nhiên ở người lớn tuổi, tình trạng tan máu diễn ra một cách mãn tính, không có giai đoạn tiến triển, hồng cầu bị giữ trong hệ thống liên võng của gan, lách và corticoid liệu pháp thường không có hiệu quả. Về lâm sàng những bệnh nhân này phải được xét nghiệm rộng như chụp hệ thống hạch hoặc sinh thiết tủy…Trong thực tế người ta thấy trong 80% các trường hợp có căn nguyên không rõ ràng thường là bệnh ác tính và liên quan đến hệ thống limpho hoặc liên võng.
c. Các trường hợp đặc biệt: Thiếu máu tan máu cấp tính có thể chữa khỏi ở trẻ em . Sau một giai đoạn viêm mũi họng khoảng 6 đến 8 ngày có thể xuất hiện một giai đoạn tan máu nặng gây lo lắng cho người nhà và bác sĩ điều trị . Xét nghiệm Coombs trực tiếp có kết quả dương tính, thuộc type bổ thể, Corticoid liệu pháp liều cao có thể cho kết quả khả quan, nhờ đó có thể tránh được việc phải truyền máu. Tình trạng tan máu sẽ giảm dần sau vài ngày, bệnh sẽ khỏi hoàn toàn sau vài tuần được theo dõi và điều trị.
d. Các thiếu máu tan máu do khối u: xét nghiệm Coombs trực tiếp dương tính có thể gặp trên một u nang buồng trứng, một khối u ác tính … sau phẫu thuật khối u cóthể làm ngừng quá trình tan máu.
e. Thiếu máu tan máu do Méthyl Dopa: ở đây thực chất là một bệnh tự miễn, hoàn toàn khác biệt với các bệnh thiếu máu tan máu miễn dịch dị ứng khác. Ở đây kháng thể không phải là một kháng thể kháng thuốc mà là một tự kháng thể . Xét nghiệm Coombs trực tiếp luôn thuộc type IgG.
f. Dấu hiệu ở những người bình thường: Nghiên cứu trên người cho máu, có thể gặp xét nghiệm Coombs trực tiếp IgG dương tính mà nguyên nhân không phải do Méthyl dopa. Những người này nên được theo dõi tình trạng thiếu máu tan máu tự miễn. Một người bị bệnh tự miễn có thể biểu hiện khỏe mạnh như trường hợp rối loạn globulin đơn dòng mà không có triệu chứng.
g. Nghiệm pháp Coombs trực tiếp âm tính trong các trường hợp AHA thực sự: các nghiên cứu cho thấy tối thiểu phải có trên 150 phân tử IgG kháng D được cố định trên hồng cầu Rh dương mới có thể làm xét nghiệm Coombs gián tiếp dương tính. Nếu các hồng cầu đã được mẫn cảm trong cơ thể ( in vivo ) có gắn ít hơn 150 phân tử tự kháng thể thì phản ứng Coombs trực tiếp có thể trở nên âm tính.
Tóm lại kết quả xét nghiệm Coombs trực tiếp dương tính là cơ sở để chẩn đoán các trường hợp AHA. Dựa vào đó có thể xác định yếu tố tự miễn dịch tự nhiên của thiếu máu tan máu, đưa ra các thông tin giúp các bác sĩ lâm sàng chẩn đoán, theo dõi và điều trị.
5.3. Các trường hợp thiếu máu tan máu giả tự miễn dịch liên quan đến đa ngưng kết: các thiếu máu đã được lưu ý trong một số trường hợp đa ngưng kết T hoặc Tn, kháng nguyên thiếu đó có thể được gắn với các kháng thể có mặt trong phần lớn huyết thanh người bình thường. Các biểu hiện về bệnh học của sự đa ngưng kết đã được xác định là “AHA giả tự miễn dịch ”
Thử nghiệm Coombs trực tiếp thường được tiến hành với một chứng AB, nếu dương tính, khi đó ta phải xác định loại đa ngưng kết trước khi tiến hành điều trị.
5.4. Xét nghiệm Coombs trực tiếp trong các thiếu máu tan máu miễn dịch dị ứng với thuốc: một số trường hợp dị ứng có giảm hồng cầu. Một số người có tăng kháng thể kháng thuốc như: pénicilline, rifampicine, glifanan…, sự mẫn cảm đặc hiệu này có thể được nhận biết bằng xét nghiệm Coombs trực tiếp.
Trong các trường hợp thiếu máu tan máu dj ứng thật sự, xét nghiệm Coombs có thể là loại IgG hoặc bổ thể. Ta sẽ tham khảo hai ví dụ sau đây:
- Thiếu máu tan máu do pénicilline có xét nghiệm Coombs dương tính loại IgG: Cơ chế bệnh sinh ở đây là: trong cơ thể bệnh nhân tăng lượng kháng thể kháng pénicilline (kháng thể này luôn thuộc týp IgG). Do pénicilline có khả năng hấp phụ lên bề mặt hồng cầu, kháng thể khi đó sẽ gắn với kháng nguyên, phức hợp này không thể tách rời được bằng biện pháp rửa. Được phát hiện bằng xét nghiệm Coombs (kháng globuline đa giá có hoạt tính kháng IgG hoặc bởi một kháng globuline đặc hiệu kháng IgG).
- Thiếu máu tan máu do rifampicine có xét nghiệm Coombs dương tính loại bổ thể: Cơ chế bệnh sinh ở đây có khác. Cơ thể bệnh nhân tạo ra một kháng thể kháng rifampicine, nó hình thành một phức hợp kháng nguyên – kháng thể trong huyết thanh. Phức hợp này sẽ được hấp phụ theo một cách đặc biệt lên hồng cầu. Tiếp theo bổ thể sẽ gắn với phức hợp trên bề mặt hồng cầu. Hồng cầu của bệnh nhân sẽ cho một phản ứng Coombs dương tính loại bổ thể.
a. Thử nghiệm Coombs gián tiếp là một trong các phản ứng rất cần trong nghiên cứu tìm ngưng kết tố và xét nghiệm hòa hợp [3]: tìm kháng thể bất thường cần được thực hiện trong các trường hợp truyền máu đầu tiên và tiếp theo nếu bệnh nhân phải truyền máu nhiều lần. Sự có mặt của một kháng thể tùy thuộc vào số lần truyền máu và thay đổi với mỗi bệnh nhân . Các kháng thể xuất hiện hoặc biến mất tùy theo các kích thích, do vậy bác sĩ phải chỉ định việc nghiên cứu đúng lúc và xét nghiệm Coombs gián tiếp là một trong những kỹ thuật nhậy cảm nhất.
b. Với xét nghiệm hòa hợp trong phòng xét nghiệm: xét nghiệm Coombs thực hiện trong môi trường có lực ion thấp (đệm LISS) [2] sẽ là một trong các phương pháp nhậy và nhanh nhất, xét nghiệm Coombs trong các thử nghiệm hòa hợp hiện nay là một quy định bắt buộc. Ngoài ra cũng cần quan tâm việc tiến hành xét nghiệm với hồng cầu được sử lý bằng men papine. Hai kỹ thuật này phối hợp sẽ tạo được khả năng cao nhất phát hiện các kháng thể miễn dịch đồng loại trong truyền máu.
c. Thử nghiệm Coombs trực tiếp với chẩn đoán các tai biến tan máu trong bất đồng hòa hợp: để thấy được tan máu trực tiếp trong lòng mạch là rất hiếm, liên quan với không hòa hợp nhóm máu hệ ABO hoặc các trường hợp không hòa hợp ở người nhận nguy hiểm. Sự phá hủy hồng cầu của người nhận diễn ra ngay và xét nghiệm Coombs thường dương tính. Ngược lại, khi người nhận có kháng thể đồng loại tương ứng với hồng cầu người cho (trước khi nó bị phá hủy bởi hiện tượng thực bào) thì xét nghiệm Coombs rất có giá trị trong chẩn đoán, do kháng thể liên quan không thể thấy được trong huyết thanh.
Xét nghiệm Coombs trực tiếp sẽ bộc lộ tính nhậy cảm của hồng cầu của người cho máu, hình ảnh hai quần thể điển hình [1]. Do vậy cần tiến hành rửa hồng cầu để thấy được kháng thể liên quan, giúp cho nghiên cứu tính đặc hiệu. Có thể xác định được một hoặc nhiều loại kháng thể liên quan với tai biến, ngay cả khi có các loại kháng thể khác có mặt trong huyết thanh không tương đồng với một hoặc nhiều loại kháng nguyên của người cho.
c. Thử nghiệm Coombs trực tiếp trong các trường hợp tai biến do những người cho máu nguy hiểm: ở đây hồng cầu bệnh nhân bị bám bởi kháng thể miễn dịch có trong huyết thanh của người cho máu nguy hiểm. Điều này nói lên rằng tai biến truyền máu ngày càng ít đi khi có sự nghiên cứu một cách hệ thống người cho máu của các trung tâm lấy máu và việc truyền khối hồng cầu với một lượng huyết tương ít nhất.
5.6. Thử nghiệm Coombs gián tiếp trong định nhóm máu: một số huyết thanh mẫu có nguồn gốc từ người là các IgG hoặc IgM đôi khi có gắn bổ thể, nó chỉ có thể sử dụng với thử nghiệm Coombs gián tiếp [1]:
a. Xác định nhóm máu Fy[sup]a[/sup] bằng xét nghiệm Coombs gián tiếp sử dụng antiglobulin anti IgG. Thuốc thử này là huyết thanh của người được kích thích miễn dịch đồng loài có các IgG chống Fy[sup]a[/sup] và chỉ có hiệu quả với xét nghiệm Coombs gián tiếp có sử dụng kháng globulin đặc hiệu chống IgG, hoặc kháng globulin đa giá có hoạt tính chống IgG.
b. Xác định nhóm Jk[sup]a[/sup] bằng xét nghiệm Coombs gián tiếp loại bổ thể với hồng cầu được sử lý bằng men trypsin: nhậy cảm nhất vẫn là xét nghiệm Coombs gián tiếp thực hiện bằng hồng cầu được sử lý bằng men trypsine với sự có mặt của bổ thể, và sử dụng trong thì hai một kháng globuline đa giá có hoạt tính kháng bổ thể, hoặc kháng bổ thể đặc hiệu.
c. Xác định nhóm máu Le[sup]a [/sup]bằng xét nghiêm Coombs gián tiếp kháng bổ thể
Rất nhiều các ví dụ khác về ứng dụng của xét nghiệm Coombs gián tiếp trong việc xác định một số các phenotype nhóm máu có thể được đưa ra ở đây, nó đặc biệt liên quan đến việc xác định các kháng nguyên Kell, Fy[sup]b[/sup], Jk[sup]b[/sup], S, s…
Có thể nói ứng dụng của kháng globulin trong xét nghiệm ngày càng nhiều và ngày càng có nhiều sinh phẩm đặc biệt áp dụng cho xét nghiệm này ra đời.
Nguồn: sưu tầm
