![[Image: XA5iYoO.jpg]](https://i.imgur.com/XA5iYoO.jpg)
NTM (Nontuberculous mycobacteria) định danh Real-time PCR
I. MỤC ĐÍCH VÀ NGUYÊN LÝ
1. Mục đích
Xác định DNA đặc trưng của NTM (Nontuberculous mycobacteria) trong mẫu bệnh phẩm của người.
2. Nguyên lý
Dựa trên nguyên lý kỹ thuật Real-time PCR.
II. CHUẨN BỊ
1. Người thực hiện
- Người thực hiện: Nhân viên xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh (và/hoặc sinh học phân tử/ sinh học/công nghệ sinh học).
- Người nhận định và phê duyệt kết quả: Người thực hiện có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh (và/hoặc sinh học phân tử/ sinh học/công nghệ sinh học).
2. Phương tiện, hóa chất (Ví dụ hoặc tương đương)
2.1. Trang thiết bị
- Máy real-time PCR đa màu và hệ thống máy vi tính.
- Bộ lưu điện
- Máy nhiệt
- Máy ly tâm > 12000 gpm/phút
- Máy ly tâm lạnh
- Tủ lạnh 2oC -8oC
- Tủ âm sâu (-20o C) ho c (-70oC) (nếu có)
- Máy vortex
- T an toàn sinh học
- Micropipettes các thể tích từ 5 µl - 1000 µl.
- Đầu côn có phin lọc các thể tích từ 5 µl - 1000 µl.
2.2. Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)
Lọ đựng bệnh phẩm vô trùng
Khay đựng bệnh phẩm
Hộp vận chuyển bệnh phẩm
Găng không có bột tal (DNase-RNase free)
Sinh phẩm và vật tư tiêu hao cho chẩn đoán
Khấu hao sinh phẩm và vật tư tiêu hao cho chạy chứng, kiểm tra chất lượng
Hóa chất và vật tư tiêu hao cho tách acid nucleic
Tube eppendorff 1,5 ml
Strip 8 tubes 0,1 ml
Nắp đậy strip 8 tubes
Đầu côn có phin lọc 1 ml
Đầu côn có phin lọc 200 µl
Đầu côn có phin lọc 10 µl
Giấy thấm không bụi
Giấy xét nghiệm
Sổ lưu kết quả xét nghiệm
Bút viết kính
Bút bi
Mũ
Khẩu trang
Găng tay xử lý dụng cụ
Quần áo bảo hộ
Dung dịch xà phòng rửa tay
Cồn sát trùng tay nhanh
Dung dịch khử trùng
Khăn lau tay
Ngoại kiểm (EQAS) (nếu thực hiện)*
* Ghi chú:
- Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/50 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 3 lần/1 năm).
3. Bệnh phẩm
Đờm, các dịch sinh học (dịch phế quản, dịch não t y, nước tiểu, phân...), mảnh sinh thiết...
4. Phiếu xét nghiệm
Điền đầy đủ thông tin theo mẫu yêu cầu
III. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ trên.
1. Lấy bệnh phẩm
Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh.
2. Tiến hành kỹ thuật
Các bộ sinh phẩm (VD hoặc tương đương):
- ExiPrep™ Dx Mycobacteria Genomic DNA Kit (Bioneer).
- Accupower MTB & NTM Real-time PCR Kit (Bioneer)
2.1. Thu nhận và xử lí mẫu
Phải đồng nhất và xử lý mẫu trước khi tách chiết DNA (nếu cần).
2.2. Tách chiết DNA, RNA
2.3. Thực hiện phản ứng real-time PCR
Thực hiện bước này với các tube PCR mix được giữ trong khay lạnh
- Cài đặt chương trình cho máy real-time PCR trước khi pha hóa chất.
- Chuẩn bị Master Mix
- Cho chứng +, chứng - hoặc dịch DNA tách chiết vào từng tube Master Mix.
- Cài đặt vị trí mẫu trên phần m m đúng với vị trí mẫu đã đ t trên máy realtime PCR.
- Chọn các kênh màu phù hợp với từng tác nhân của mẫu, chứng dương và chứng âm.
- Lưu file dữ liệu vào máy tính
- Cho máy real-time PCR chạy chương trình.
IV. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
1. Điều kiện của phản ứng
- Chứng dương có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang tuyến tính vượt quá tín hiệu nền và đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang cho chứng nội dương tính hoặc thẳng và không vượt qua tín hiệu nền (đường biểu diễn âm tính).
- Chứng âm có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang âm tính và đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang chứng nội dương tính
2. Phân tích mẫu
- Mẫu dương tính: Mẫu có đường biểu diễn dương tính rõ ràng tương ứng với màu FAM và máy báo DETECTED.
- Mẫu âm tính: Mẫu có đường biểu diễn âm tính, chứng nội phải dương tính và và máy báo NON-DETECTED
V. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
1. Sự cố: Có mẫu và chứng nội cũng đ u âm tính. Chứng bình thường, có mẫu dương, mẫu âm thật sự.
2. Nguyên nhân: Có thể mẫu âm thực sự, có thể phản ứng PCR bị ức chế.
3. Khắc phục: Pha loãng mẫu từ 10-100 lần, thực hiện lại toàn bộ thí nghiệm từ bước tách chiết. Sau khi có kết quả phải nhân thêm với hệ số pha loãng mẫu. Nếu vẫn gặp sự cố trên, lấy lại mẫu theo đúng yêu cầu.