[SOP] MTB IGRA (Interferon γ Assay)

[tuyenlab]

MTB IGRA (Interferon γ Assay)

I. MỤC ĐÍCH VÀ NGUYÊN LÝ

1. Mục đích

Xét nghiệm hỗ trợ phát hiện nhiễm M. tuberculosis thông qua việc phát hiện interferon γ (IFN-γ) bằng kỹ thuật ELISA.

2. Nguyên lý

Phát hiện interferon γ do các tế bào miễn dịch tạo ra khi bị kích thích bởi các mycobacterial peptides (ESAT-6, CFP-10 và TB7.7(p4)) dựa trên nguyên lý của kỹ thuật ELISA.

II. CHUẨN BỊ

1. Người thực hiện:

- Người thực hiện: Người thực hiện đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành xét nghiệm.

- Người nhận định và phê duyệt kết quả: Người thực hiện có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành xét nghiệm.

2. Phương tiện, hóa chất (Ví dụ hoặc tương đương)

2.1. Trang thiết bị

- Tủ ấm thường

- Dàn máy ELISA

- Máy ly tâm thường

- Máy lắc phiến nhựa

- Máy Vortex

- Máy đọc phiến nhựa bước sóng 450 nm và 620 – 650 nm

- Tủ lạnh 2oC - 8oC

- Micropipette đơn kênh thể tích từ 10 µl đến 1000 µl.

- Bộ micropipette 8 kênh thể tích từ 50 µl đến 200 µl

2.2. Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)

Bông

Dây garô

Cồn

Bơm kim tiêm

Panh

Khay đựng bệnh phẩm

Hộp vận chuyển bệnh phẩm

Tube đựng bệnh phẩm

Sinh phẩm chẩn đoán

Khấu hao sinh phẩm cho chạy chứng, kiểm chất lượng

Chứng ngoại kiểm âm (nếu có)

Chứng ngoại kiểm dương (nếu có)

Ngoại kiểm (EQAS) (nếu có)*

Nước cất

Đầu côn 1000 µl

Đầu côn 200 µl

Giấy thấm

Giấy xét nghiệm

Sổ lưu kết quả xét nghiệm

Bút viết kính

Bút bi

Mũ

Khẩu trang

Găng tay

Găng tay xử lý dụng cụ

Quần áo bảo hộ

Dung dịch xà phòng rửa tay

Cồn sát trùng tay nhanh

Dung dịch khử trùng

Khăn lau tay

* Ghi chú: Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/50 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 4 lần/1 năm).

3. Bệnh phẩm

Máu toàn phần 4 ml lấy vào 4 ống, mỗi ống 1 ml theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

4. Phiếu xét nghiệm

Điền đầy đủ thông tin theo mẫu yêu cầu

III. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ trên.

1. Lấy bệnh phẩm

- Lấy 1mL máu tĩnh mạch vào trong mỗi ống QFT (4 ống).

- Sau khi lấy máu xong, lập tức lắc các ống khoảng 10 lần vừa đ mạnh để đảm bảo toàn bộ bề mặt bên trong của ống được phủ máu (để hòa tan) toàn bộ các kháng nguyên trên thành ống.

- Chuyển các ống tới phòng xét nghiệm nhiệt độ 17 – 27°C.

- Máu phải được ấm nhiệt độ 37°C càng sớm càng tốt (và trong vòng16 giờ sau khi lấy máu)

2. Tiến hành kỹ thuật

Bộ sinh phẩm QuantiFERON®-TB Gold (QFT®) plus (VD hoặc bộ sinh phẩm tương đương)

2.1. Bước 1

- Máu phải được ấm càng sớm càng tốt (trong vòng 16 giờ sau khi lấy máu)

- Ủ ấm các ống vị trí đặt thẳng đứng 37°C trong 16 – 24 giờ.

- Không cần điều kiện độ ẩm/CO2.

2.2. Bước 2

- Ly tâm các tube 2000–3000g (RCF) trong thời gian 15 phút.

2.3. Bước 3

Tách huyết tương

- Các mẫu Huyết tương nên chỉ được thu bằng pipette

- Các mẫu huyết tương có thể được lấy trực tiếp từ các ống QFT đã ly tâm vào các giếng ELISA, bao gồm cả khi sử dụng

dàn ELISA tự động.

- Các mẫu huyết tương đã tách có thể được bảo quản trong 28 ngày nhiệt độ 2–8°C, dưới –20°C trong thời gian dài hơn.

2.4. Bước 4

- Đánh số, sắp xếp bệnh phẩm và viết sơ đồ theo thứ tự.

2.5. Bước 5

- Chuẩn bị hóa chất ELISA

- Hiệu chỉnh Lọ Standard và Conjugate

2.6. Bước 6

- Vẽ sơ đồ thực hiện

2.7. Bước 7

- Chuẩn bị dung dịch Standard và dung dịch Working Strength

2.8. Bước 8

- Chuẩn bị số Trip trên đĩa ELISA đủ cho số lượng mẫu

2.9. Bước 9

- Lấy 50µL dung dịch working strength vao mỗi giếng ELISA

- Lấy 50µL huyết tương vào các giếng ELISA mẫu (trừ các giếng S1,S2,S3,S4)

- Lấy 50µL dung dịch S1, S2, S3, S4 theo thứ tự đã ghi sơ đồ

2.10. Bước 10

Lắc đĩa trong thời gian 1 phút nhiệt độ phòng trong thời gian 2 giờ (Cần bọc đia ELISA để

tránh tiếp xúc ánh sáng trực tiếp.

2.11. Bước 11

- Chuẩn bị dịch rửa

2.12. Bước 12

- Hút 100µL dung dịch Substrate vào mỗi giếng

- Phủ kín và nhiệt độ phòng trong thời gian 30 phút

- Cho tiếp 50µL dung dịch stopping solution vào mỗi giếng và lắc

2.13. Bước 13

- Đo OD bước sóng 450nm và tham chiếu bước sóng 620nm trong vòng 5 phút khi dừng phản ứng

2.14. Bước 14

- Sử dụng phần mềm QFT 2.7.1 để phân tích kết quả

IV. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

1. Xác nhận kết quả khi:

- Gía trị trung bình OD cho Standard 1 phải ≥ 0,600

- %CV của các giá trị lặp lại của Standard 1 và Standard 2 phải ≤ 15%

- Các giá trị OD lặp lại c a Standard 3 và Standard 4 phải không sai khác qua 0,040 đơn vị OD so với giá trị trung bình của nó.

- Hệ số tương quan tính từ các giá trị trung bình của các Standards phải ≥0,98.

2. Diễn giải kết quả

V. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

1. Sai sót

Kết quả không xác định hoặc không tin cậy có thể do:

- Thực hiện sai các bước trong quy trình hướng dẫn.

- Mẫu từ lúc lấy đến lúc được 37ºC lâu hơn 16 tiếng.

- Lượng interferon γ quá nhiều heterophile antibody.

2. Xử trí

- Tuân thủ đúng các bước qui trình hướng dẫn của nhà sản xuất và hướng dẫn về độ ổn định hóa chất xét nghiệm trong bộ sinh phẩm sử dụng. 

Nguồn: Quyết định số: 6769/QĐ-BYT - Về việc ban hành tài liệu Hướng dẫn quy trình kỹ thuật chuyên ngành Vi sinh