02-05-2016, 12:02 PM
HBV đo tải lượng Real-time PCR
I. MỤC ĐÍCH VÀ NGUYÊN LÝ
1. Mục đích
Đo số lượng bản sao HBV DNA trong một đơn vị thể tích huyết thanh hoặc huyết tương (copies/ml).
2. Nguyên lý
Dựa trên nguyên lý của kỹ thuật Real-time PCR.
II. CHUẨN BỊ
1. Người thực hiện
- Người thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.
- Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.
2.Phương tiện, hóa chất
Phương tiện, hóa chất như ví dụ dưới đây hoặc tương đương.
2.1. Trang thiết bị
- Máy real-time PCR và hệ thống máy vi tính.
- Bộ lưu điện
- Máy ủ nhiệt
- Máy ly tâm dung cho tube 0,2 ml
- Máy ly tâm 25000 x g
- Tủ lạnh 2oC -8oC
- Tủ âm sâu (-20oC) hoặc (-70oC) (nếu có)
- Máy vortex
- Tủ an toàn sinh học
- Micropipettes các thể tích từ 5 ul – 1000 ul.
2.2. Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)
Bông
Dây garô
Cồn
Bơm kim tiêm
Panh
Khay đựng bệnh phẩm
Hộp vận chuyển bệnh phẩm
Tube đựng bệnh phẩm
Găng không có bột tal
Sinh phẩm chẩn đoán
Khấu hao sinh phẩm cho chạy chứng và kiểm tra chất lượng
Kít tách DNA
HBV Standard
EQAS (nếu thực hiện)*
Ependoff 1,7ml
Ependoff 0,2ml
Đầu côn 10 µl có lọc
Đầu côn 30 µl
Đầu côn 200 µl có lọc
Đầu côn 1 ml có lọc
Ethanol BDH
Water-DEPC Treated
Giấy thấm
Giấy xét nghiệm
Sổ lưu kết quả xét nghiệm
Bút viết kính
Bút bi
Mũ
Khẩu trang
Găng tay xử lý dụng cụ
Quần áo bảo hộ
Dung dịch nước rửa tay
Cồn sát trùng tay nhanh
Dung dịch khử trùng
Khăn lau tay
* Ghi chú: Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) ) là 1/50 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 2 lần/1 năm).
3.Bệnh phẩm
Huyết thanh, huyết tương hoặc máu toàn phần
4.Phiếu xét nghiệm
Điền đầy đủ thông tin theo mẫu yêu cầu
III. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.
1. Lấy bệnh phẩm
- Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh (xem phụ lục 3)
- Từ chối những bệnh phẩm không đạt yêu cầu (xem phụ lục 6).
2. Tiến hành kỹ thuật: Bộ sinh phẩm HBV Real-time Quant (VD)
2.1. Tách chiết DNA
2.2. Thực hiện phản ứng real-time PCR
- Thực hiện bước này với các tube PCR mix được giữ trong khay lạnh hoặc đá đang tan.
- Chỉ lấy đủ số tube PCR mix cần
- Trước và sau khi đặt phản ứng PCR phải ly tâm tube để tất cả dung dịch nằm dước đáy tube.
- Cho chứng +, chứng - hoặc dịch DNA tách chiết vào từng tube HBV qPCR Mix. Xong, đặt các tube vào máy real-time PCR cùng với 1 bộ standard.
- Khởi động máy real-time PCR. Khởi động máy tính và chương trình real- time PCR.
- Cài đặt vị trí mẫu “Plate setup” trên phần mềm đúng với vị trí mẫu đã đặt trên máy real-time PCR.
- Chọn màu “FAM” cho standard. Màu “FAM” và “HEX” cho mẫu, chứng dương và chứng âm.
- Cài đặt chương trình “Protocol” cho máy real-time PCR hoạt động
- Lưu file dữ liệu vào máy tính.
- Cho máy real-time PCR chạy chương trình.
IV. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
1. Điều kiện của phản ứng
- Chứng dương có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu FAM dương tính và đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu HEX dương tính hoặc âm tính
- Chứng âm có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu FAM âm tính và đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu HEX dương tính
2. Phân tích standard
- Hệ số tuyến tính (R2) phải nằm trong khoảng 0.960-1.000, tốt nhất 0.990- 1.000.
- Hiệu suất nhân bản (PCR efficiency) phải nằm trong khoảng 90-115%, tốt nhất 95-110%.
- Hệ số dốc (Slope) phải nằm trong khoảng -3 đến -4, tốt nhất -3.3 đến -3.6.
3. Phân tích mẫu
- Ngưỡng phát hiện của bộ kit là 3x102 copies/ml
- Những mẫu dương tính chỉ cần chọn màu FAM để phân tích
Các kết quả dương tính được nhân với hệ số pha loãng tuỳ thuộc vào loại kit tách chiết DNA sẽ thu được kết quả hàm lượng virus/ml máu (copies/ml), do đó kết quả sau khi nhân:
+ Nếu ≥ 3x102 thì kết luận “Mẫu dương tính: a copies/ml”
+ Nếu < 3x102 thì kết luận “Mẫu dương tính dưới ngưỡng định lượng”.
- Những mẫu âm tính, chứng nội phải dương tính thì mới kết luận mẫu âm tính thật sự.
4. In đồ thị kết quả
V. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
Có mẫu và chứng nội cũng đều âm tính. Chứng bình thường, có mẫu dương, mẫu âm thật sự.
1. Nguyên nhân: Có thể mẫu âm thực sự, có thể phản ứng PCR bị ức chế.
2. Khắc phục
- Pha loãng mẫu từ 10-100 lần, thực hiện lại toàn bộ thí nghiệm từ bước tách chiết. Sau khi có kết quả phải nhân thêm với hệ số pha loãng mẫu. Nếu vẫn gặp sự cố trên, lấy lại mẫu theo đúng yêu cầu.
- Trừ những mẫu sự cố, tất cả các mẫu bình thường đều có thể lấy kết quả.
Theo quyết định số 26 /QĐ-BYT ngày 03 tháng 01 năm 2013