[SOPs] XÉT NGHIỆM GEN BẰNG KỸ THUẬT FISH VỚI TIÊU BẢN PARAFFIN

[tuyenlab]

XÉT NGHIỆM GEN BẰNG KỸ THUẬT FISH VỚI TIÊU BẢN PARAFFIN

(Fluorescence in situ hybridization for paraffin-embedded tissue sections)

I. NGUYÊN LÝ

Kỹ thuật FISH được tiến hành dựa trên cơ sở của phản ứng lai ghép. Trong tế bào, phân tử ADN tồn tại dưới dạng phân tử kép gồm 2 chuỗi đơn gắn kết bổ sung với nhau thông qua liên kết hydro. Liên kết hydro là liên kết yếu nên dễ dàng bị đứt gãy dưới tác động của nhiệt độ hay pH cao. Lúc đó, phân tử AlDN bị tách thành 2 chuỗi đơn. Tuy nhiên khi nhiệt độ hay pH giảm, các chuỗi đơn lại ghép nhau theo nguyên tắc bổ sung.

Dựa trên đặc tính này, kỹ thuật FISH sử dụng các probe là đoạn AlDN đặc hiệu có gắn huỳnh quang để lai ghép với các đoạn AlDN tương đồng trên nhiễm sắc thể. Từ đó, chúng ta có thể phát hiện bất thường nhiễm sắc thể một cách chính xác và nhanh chóng.

II. CHỈ ĐỊNH

Chỉ định cho các bệnh lý ác tính và thực hiện với các mô sinh thiết đúc paraffin.

III. CHỐNG CHỈ ĐỊNH

Không có chống chỉ định.

IV. CHUẨN BỊ

1.  Người thực hiện

Nhân viên xét nghiệm di truyền - sinh học phân tử đã được đào tạo.

2.  Phương tiện, hóa chất

2.1.Phương tiện

-     Thiết bị: bể ổn nhiệt, máy lai, máy ly tâm, máy trộn mẫu, và kính hiển vi huỳnh quang.

-   Dụng cụ: kẹp kim loại, 10 cóng Coplin, nhiệt kế, coverslip 22x22, pipetman 100 ul, 10 ul, xi măng cao su, ống đong, giấy thấm.

2.2. Hóa chất

-     Probe phù hợp tương ứng với đoạn gen cần phát hiện.

-     DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindol.2HCl)/ antifade.

-     Dung dịch xử lý tiêu bản.

-     Protease buffer.

-     Dung dịch PBS (phosphate buffered saline).

-     Xi măng cao su (rubber cement): Fixogum™.

-     Dung dịch phân giải protein:

+ Dung dịch 2 X SSC.

+ Dung dịch rửa 2 X SSC, 0,05% Tween20, pH 7.0.

+ Cồn 100o.

+ Xylene

+ Dung dịch 0,4 X SSC.

2.3. Người bệnh

Các đối tượng người bệnh có chỉ định của lâm sàng.

V. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

1.  Chuẩn bị tiêu bản

- Cho tiêu bản paraffin vào tủ ấm 60oC tối thiểu 2 tiếng trước khi loại bỏ paraffin.

- Loại bỏ paraffin:

+ Làm nóng tiêu bản paraffin lên 60oC.

+ Chuyển tiêu bản paraffin ở 60oC vào cóng chứa xylene trong 10 phút.

+ Chuyển tiêu bản paraffin qua hai cóng chứa c ồ n 100oC, mỗi cóng trong 5 phút. Để khô tiêu bản parafin tự nhiên.

+ Chuyển tiêu bản paraffin vào cóng chứa dung dịch xử lý tiêu bản từ 10 đến 15 phút. (pH = 6.0, 96-98oC).

+ Rửa tiêu bản chứa paraffin qua cóng chứa dung dịch 2X SSC ở nhiệt độ phò ng trong 5 phút.

+ Chuyển tiêu bản chứa paraffin qua cóng chứa dung dịch enzym phân giải protein (40ml protease buffer + 100gl protease).

+ Rửa tiêu bản chứa paraffin qua cóng chứa dung dịch 2X SSC ở nhiệt độ phò ng trong 5 phút.

+ Chuyển tiêu bản paraffin qua cóng chứa c ồ n 100oC trong 2 phút.

+ Để khô tự nhiên.

2.  Lai huỳnh quang tại chỗ

2.1. Chuẩn bị probe

-     Trộn đều các dung dịch sau trong 1 ống PCR (1 gl probe + 7 gl LSI + 2 gl dH2O) /ltiêu bản

-     Ly tâm nhẹ.

2.2. Lai

-    Nhỏ 10 pl dung dịch probe vào khu vực đánh dấu trên tiêu bản sau đó che phủ bằng coverslip.

Yêu cầu: dung dịch probe thấm đều trên tiêu bản, không có bọt khí.

-     Phủ kín coverslip bằng cao su xi măng.

-    Đặt tiêu bản vào máy lai, chọn chương trình biến tính ở 73oC trong 3 phút và ủ 37oC trong 16 - 20 giờ.

2.3. Rửa sau khi lai

-     Gỡ bỏ xi măng cao su và coverslip.

-     Ngâm và lắc mạnh tiêu bản lần lượt qua các cóng Coplin sau:

+ Dung dịch 0,4X SSC, pH 7.0: 2 phút, 73oC.

+ Dung dịch 2X SSC, Tween20 (pH7.0): 30 giây, nhiệt độ phòng.

-     Rửa nhanh bằng nước cất.

-     Làm khô tiêu bản.

VI. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

-     Nhỏ 10-20 pl dung dịch antifade lên bề mặt tiêu bản để chống mất màu probe và ổn định tín hiệu DAPI trên tương bào.

-     Phủ kín tiêu bản bằng coverslip.

Yêu cầu: dung dịch dàn đều trên tiêu bản và không có bọt khí.

-     Quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang với màng lọc thích hợp.

-      Quy tắc phân tích theo hướng dẫn cụ thể của nhà sản xuất cho từng loại probe. Thông thường sẽ tiến hành phân tích 100 tương bào để đưa ra kết quả cuối cùng.

VII. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

[b]Nguồn: Quyết định 3336/QĐ-BYT ngày 20/7/2017 của Bộ trưởng Bộ Y tế về việc ban hành tài liệu Hướng dẫn quy trình kỹ thuật Huyết học - Truyền máu - Miễn dịch - Di truyền - Sinh học phân tử.[/b]