[SOPs] XÉT NGHIỆM XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN THALASSEMIA

[tuyenlab]

XÉT NGHIỆ M XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN THALASSEMIA 

(Phát hiện đồng thời 21 đột biến a-thalassemia hoặc 22 đột biến p-thalasemia) 

THALASSEMIA MULTIPLE MUTATIONS DETECTION 

(Simultaneously detects of 21 gene mutations of a-thalassemia or 22 gene mutations of p -thalassemia)

I.      NGUYÊN LÝ

Xét nghiệm xác định đột biến thalassemia sử dụng bộ sinh phẩm a-globin và p- globin stripassay được phát triển dựa trên nguyên lý của kỹ thuật lai ADN ngược. Kỹ thuật sử dụng thanh teststrip có đính nhiều đầu dò để phát hiện đột biến và xác định tính đồng hợp/ dị hợp tử của đột biến. Bộ xét nghiệm a-globin stripAssay cho phép sàng lọc 21 đột biến a-thalassemia và bộ xét nghiệm p-globin stripAssay cho phép sàng lọc 22 đột biến p-thalasemia phổ biến trong khu vực Đông Nam Á.

II.      CHỈ ĐỊNH

Chỉ định cho người bệnh thalassemia và các trường hợp nghi ngờ mang đột biến gen globin liên quan đến bệnh lý huyết sắc tố.

III.      CHỐNG CHỈ ĐỊNH

Không có chống chỉ định.

IV.      CHUẨN BỊ

1.     Người thực hiện

-     Nhân viên xét nghiệm sinh học phân tử đã được đào tạo.

2.      Phương tiện - Hóa chất

2.1.      Phương tiện

-     Buồng vô trùng (Biology cabinet);

-     Máy ly tâm tốc độ cao (tốc độ tối đa 14.000 vòng/phút);

-     Máy vortex;

-     Các loại pipet 10 ul, 20 ul, 100 ul, 200 ul, 1000 ul;

-     Đầu côn có màng lọc;

-     Ông eppendorf 1,5 ml vô trùng, không có enzym nuclease;

-     Ông PCR 0,2 ml vô trùng, không có enzym nuclease;

-     Tủ lạnh 4-8oC, tủ -20oC;

-     Găng tay.

2.2 Hóa chất:

-    Sử dụng sinh phẩm tách ADN thương mại. Nếu tách thủ công thì sử dụng các sinh phẩm cần thiết để tách chiết ADN như dung dịch ly giải màng tế bào, dung dịch biến tính protein, các dung dịch rửa, cồn tuyệt đối.

-     Bộ sinh phẩm a-Globin Stripassay và P-Globin Stripassay.

3.      Bệnh phẩm

2 ml máu toàn phần đựng trong ống chống đông EDTA.

4.      Phiếu xét nghiệm

Có đầy đủ các thông tin cần thiết về người bệnh như: tên, tuổi, nơi ở, chẩn đoán ban đầu, yêu cầu xét nghiệm.

V.      CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

1.     Lấy bệnh phẩm

-    2 ml máu ngoại vi chống đông bằng EDTA, bảo quản mẫu trong -200C nếu chưa th c hiện x t nghiệm.

2.      Tiến hành kỹ thuật 

Bước 1 : Tách chiết ADN

Phương pháp tách chiết ADN cơ bản bao gồ m các giai đoạn chính sau:

Phá màng tế bào và màng nhân:

-    Tế bào được ủ trong một dung dịch gồ m chất tẩy mạnh (như SDS, sarcosyl), chất g ây biến tính protein (guanidinium thyocianat) và chất khử (2-mercaptoethanol). Mục đích của bước này là để phá màng tế bào và màng nhân đồng thời để ức chế hoạt động của các enzym RNase nội bào, biến tính protein để giải phóng các phân tử ADN ở trạng thái tự do.

Loại bỏ các protein:

Sử dụng dung dịch phenol: chloroform để biến tính protein, làm cho protein tạo thành một lớp tủa rõ rệt sau khi ly tâm, dễ dàng loại b ỏ khỏ i hỗn dịch.

Tủa ADN:

Sử dụng isopropanol hoặc ethanol với muối để tủa ADN trong điều kiện nhiệt độ âm sâu rồi thu nhân ADN bằng ly tâm. ADN được tái hò a tan trong nước tinh sạch đã khử enzym (free-nuclease).

Bước 2. Thực hiện phản ứng PCR

1. Giữ tất cả hóa chất và ADN khuôn trong khay giữ lạnh. Tiến hành tất cả các bước ở trên khay trữ lạnh (0-4oC) cho đến khi bắt đầu chạy máy.

2.  Chuẩn bị dịch hỗn hợp gồ m Taq ADN Polymerase và Taq Dilution Buffer.

Chuẩn bị thành phần cho phản ứng PCR theo bảng sau:

Bước 3. Điện di kiêm tra ADN sản phâm PCR

- Kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di trên gel 3% (không bắt buộc).

Bước 4. Qui trình lai ADN

Trước khi lai: khởi động bể ổn nhiệt và máy lắc ổn nhiệt tới 45°C (± 0.5°C). Cho lọ Hybridization Buffer và Wash Solution A vào bể ổn nhiệt để làm ấm trước khi sử dụng

4.1.      Lai ADN với teststrip (45°C; máy lắc ổn nhiệt)

1.    Kiểm tra nhiệt độ của bể ổn nhiệt và máy lắc. Đảm bảo đạt 45oC trước khi tiến hành.

2.    Để tất cả teststrip, ADNT, Conjugate Solution, Wash Solution B và Color Developer ra nhiệt độ phòng.

3.    Lấy máng lai và viết ký hiệu trên mỗi rãnh tương ứng với teststrip của mỗi người bệnh.

4.    Sử dụng kẹp hoặc nhíp sạch lấy teststrip cho 1 mẫu bệnh phẩm (chỉ cầm teststrip khi đã đeo bao tay!). Ghi ký hiệu ở ngoài vạch đánh dấu của teststrip sử dụng bút chì (không sử dụng bút bi, bút đánh dấu...).

Trộn thành phần cho phản ứng lai theo bảng sau:

6.  Đê yên 5 phút ở nhiệt độ phòng.

7.   Thêm 1 ml Hybridization Buffer (đã làm ấm tới 45°C) trong mỗi rãnh. Lắc máng lai nhẹ nhàng (màu xanh sẽ biến mất)

• Hút 10 pl ADNT vào góc của mỗi rãnh đã đánh dấu trong máng lai.

•  Thêm 10 pl sản phẩm PCR vào giọt ADNT tương ứng. Trộn đều bằng pipette. (Dung dịch sẽ duy trì màu xanh)

8.   Chèn teststrip A hoặc teststrip B đã đánh dấu vào lần lượt các rãnh. Nhấn ch m hoàn toàn teststrip.

9.     Ủ 30 phút ở 45°C trong máy lắc ổn nhiệt, Tốc độ 250 rpm, đây nắp khi ủ

10.         Kết thúc ủ, loại b ỏ đệm lai bằng pipet.

p-globin stripassay

4.2.      Rửa teststrip (45°C; máy lắc ổn nhiệt)

1.   Thêm 1 ml Wash Solution A (đã làm ấm tới 45°C). Rửa nhanh (10 giây). Loại b dịch bằng pipet.

2.     Thêm 1 ml Wash Solution A (45°C).

3.     Ủ 15 phút ở 45°C trong bê ổn nhiệt. Loại bỏ dịch bằng pipet.

4.     Thêm 1 ml Wash Solution A (45°C).

5.     Ủ 15 phút ở 45°C trong bê ổn nhiệt. Loại bỏ dịch bằng pipet.

Sau bước này cài nhiệt độ và 25oC và mở nắp máy lắc.

4.3.      Hiện màu (nhiệt độ phòng)

1.     Thêm 1 ml Conjugate Solution.

2.     Ủ 15 phút ở nhiệt độ phòng trên máy lắc. Loại bỏ dịch bằng pipet.

3.     Thêm 1 ml Wash Solution B. Rửa nhanh (10 giây). Loại bỏ dịch bằng pipet.

4.     Thêm 1 ml Wash Solution B.

5.     Ủ 5 phút ở nhiệt độ phò ng trên máy lắc. Loại b ỏ dịch bằng pipet.

6.     Thêm 1 ml Wash Solution B.

7.     Ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng trên máy lắc. Loại b ỏ dịch bằng pipet.

8.     Thêm 1 ml Color Developer.

9.     Ủ 15 phút ở nhiệt độ phòng trong tối và trên máy lắc.

Chất nhuộm mầu tía sẽ xuất hiện trên phản ứng dương tính.

10.     Rửa teststrip vài lần với nước khử ion.

11.     Để teststrip khô trong tối trên giấy thấm.

Tránh để teststrip tiếp xúc với ánh sáng mạnh sau khi phát triển màu.

VI.   NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

-    Kiểu gen của một mẫu xét nghiệm được xác định từ teststrip tương ứng, qua việc đối chiếu teststrip với thang đo.

-    Kết quả chỉ được chấp nhân khi xuất hiện đủ 3 vạch: vạch Control trên cùng, vạch Control và vạch Control B.

-     Mẫu dị hợp tử khi xuất hiện đồng thời cả vạch đột biến và vạch kiểu dại

-    Mẫu đồng hợp tử một đột biến khi xuất hiện vạch đột và không xuất hiện vạch kiểu dại.

VII.   NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

Lấy mẫu không đủ hoặc sai chất chống đông -> Hướng dẫn qui cách lấy mẫu rõ ràng

Thao tác pipet không chính xác -> Sử dụng pipet theo đúng thể tích qui định.

Tín hiệu phản ứng không rõ ràng ->  Bảo quản hóa chất đúng theo khuyến cáo của nhà sản xuất. Thực hiện đúng, đủ các bước trong qui trình xét nghiệm.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Tài liệu hướng dẫn đi kèm bộ sinh phẩm a-Globin Stripassay và P-Globin Stripassay

Nguồn: Quyết định 3336/QĐ-BYT ngày 20/7/2017 của Bộ trưởng Bộ Y tế về việc ban hành tài liệu Hướng dẫn quy trình kỹ thuật Huyết học - Truyền máu - Miễn dịch - Di truyền - Sinh học phân tử.