[SOPs] XÉT NGHIỆM KHÁNG THỂ KHÁNG TIỂU CẦU TRỰC TIẾP VÀ GIÁN TIẾP

[tuyenlab]

XÉT NGHIỆM KHÁNG THỂ KHÁNG TIỂU CẦU TRỰC TIẾP VÀ GIÁN TIẾP

BẰNG KỸ THUẬT FLOW CYTOMETRY

I. NGUYÊN LÝ

-Trên bề mặt tiểu cầu có các kháng nguyên tiểu cầu HPA, kháng nguyên bạch cầu HLA và kháng nguyên nhóm máu ABO. Trong những điều kiện nhất định, có thể có thể sinh các tự kháng thể chống lại các kháng nguyên tiểu cầu của chính mình (bệnh giảm tiểu cầu miễn dịch) hoặc sinh kháng thể đồng loại chống các kháng nguyên tiểu cầu truyền vào. Các kháng thể kháng tiểu cầu có thể tồ n tại tự do trong huyết tương hoặc đã gắn trên bề mặt tiểu cầu.Hầu hết các kháng thể này là kháng thể miễn dịch có bản chất là IgG.

- Dùng kháng thể đơn dòng gắn huỳnh quang kháng IgG người có thể phát hiện được kháng thế kháng tiểu cầu trực tiếp (kháng thể đã gắn lên tiểu cầu) hoặc kháng thể kháng tiểu cầu gián tiếp (kháng thể t do trong huyết tương).

II. CHỈ ĐỊNH

-     Người bệnh xuất huyết giảm tiểu cầu nghi do miễn dịch;

-     Người bệnh truyền máu, tiểu cầu nhiều lần;

-     Người bệnh truyền tiểu cầu không hiệu lực.

III. CHỐNG CHỈ ĐỊNH

Không có chống chỉ định.

IV. CHUẨN BỊ

1.  Người thực hiện

-     Kỹ thuật viên, cử nhân đã được đào tạo thực hiện kỹ thuật;

-     Bác sỹ xét nghiệm: đọc kết quả, đánh giá, kiểm tra chất lượng.

2. Phương tiện hóa chất

2.1. Phương tiện

-     Máy phân tích tế bào dò ng chảy (máy flow cytometry);

-     Máy ly tâm;

-     Máy lắc trộn (máy votex);

-     Pipet và đầu pipet các loại 250 và 1.000 microlit;

-     Các ống nghiệm chuyên dụng cho flow cytometry;

-     Găng tay làm xét nghiệm.

2.2. Hóa chất

-     Anti CD61-PE;

-     Anti human IgG-FITC;

-     Anti human IgM-FITC;

-     Dung dịch PBS-EDTA;

-     Dung dịch sheath chạy máy flow;

-     Nước cất, hóa chất khử trùng Natri hypoclorite;

-     Mẫu chứng âm: lag mẫu huyết thanh người không có kháng thể kháng tiểu cầu;

-     Mẫu chứng dương: là mẫu huyết thanh người có kháng thể kháng tiểu cầu;

-     5 mẫu tiểu cầu của người cho máu cùng nhóm ABO với người bệnh.

3.Bệnh phẩm

Cần 2 mẫu máu (1 mẫu chống đông natri citrate, 1 mẫu đông) lấy từ người bệnh có chỉ định làm xét nghiệm.

V. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

1. Lấy bệnh phẩm

- Người bệnh: 2 ml máu chống đông bằng natri citrate; 2 ml máu đông;

- 5 mẫu tiểu cầu người cho cùng nhóm ABO của người bệnh (lấy từ các dây tiểu cầu của túi tiểu cầu trong ngân hàng máu;

- Mẫu chưa làm ngay có thể giữ trong tủ lạnh 2-8oC trong vòng 3 ngày.

2. Tiến hành kỹ thuật

2.1. Với xét nghiệm kháng thể kháng tiểu cầu trực tiếp

-     Chuẩn bị bệnh phẩm

+ Ly tâm ống máu người bệnh chống đông bằng natri citrate để tách huyết tương giầu tiểu cầu: ly tâm 500 vòng/phút trong 15 phút ở nhiệt độ thường.

+ Rửa tiểu cầu 2 lần bằng dung dịch PBS-EDTA: ly tâm 3000 vòng/phút trong 5

phút.

+ Pha huyền dịch tiểu cầu trong PBS-EDTA nồ ng độ 1 x10^7/ml.

-     Ủ kháng thể

+ Ủ 100 microlit huyền dịch tiểu cầu với các kháng thể đơn dòng theo sơ đồ sau. Thời gian ủ 20 phút ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sang. Sơ đồ ủ mẫu như sau:

+ Sau ủ kháng thể, rửa bỏ kháng thể thừa 2 lần bằng dung dịch PBS -EDTA, ly tâm 3000 vò ng/phút x 5 phút. Đổ bỏ dịch nỗi giữ lại cặn tế bào.

+ Sau rửa, tái huyền dịch tiểu cầu trong 1 ml dung dịch PBS-EDTA và trộn đều. Lúc này ống đã sẵn sang cho phân tích.

2.2. Với xét nghiệm kháng thể kháng tiểu cầu gián tiếp 

- Chuẩn bị bệnh phẩm 

+ Chuẩn bị tiểu cầu giá thể:

•      Trộn 5 mẫu tiểu cầu cùng nhóm ABO người bệnh với tỷ lệ tương đương.

•      Rửa tiểu cầu 2 lần bằng dung dịch PBS-EDTA: ly tâm 3000 vò ng/phút trong 5

phút.

•      Pha huyền dịch tiểu cầu trong PBS-EDTA nồng độ 1 x107/ml.

+ Tách huyết thanh người bệnh từ ống máu đông

+ Mẫn cảm tiểu cầu giá thể

+ Ủ 100 microlit tiểu cầu giá thể với huyết thanh chứng âm, huyết thanh chứng dương và huyết thanh người bệnh theo sơ đồ sau

•     Ủ 60 phút ở 37o, trong tối.

•      Sau ủ rửa tiểu cầu giá thể đã mẫn cảm huyết thanh người bệnh bằng dung dịch PBS-EDTA, ly tâm 3.000 vòng/phút x 5 phút.

• Tái huyền dịch cặn tiểu cầu trong các ống 3, 4, 5, 6 trong 100 gl BPS-EDTA.

- Ủ kháng thể

+ Ủ 100 microlit huyền dịch tiểu cầu với các kháng thể đơn d ò ng theo sơ đồ sau.

Thời gian ủ 20 phút ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng.

+ Sau ủ kháng thê, rửa b ỏ kháng thê thừa 2 lần băng dung dịch PBS -EDTA, ly t âm 3000 vò ng/phút x 5 phút. Đổ bỏ dịch nỗi giữ lại cặn tế bào. 

+ Sau rửa, tái huyền dịch tiêu cầu trong 1 ml dung dịch PBS-EDTA và trộn đều. Lúc này ống đã sẵn sang cho phân tích.

3. Phân tích kháng thể kháng tiểu cầu trên máy flow cytometry

-  Đưa các ống flow cytometry đã chuẩn bị ở trên (ống 1, 2...5, 6,7) vào vị trí đọc trên máy.

-  Mở chương trình phân tích kháng thê kháng tiêu cầu đã lập sãn trên máy. Nhập vị trí ống phân tích và chạy chương trình phần mềm phân tích.

V. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

-     Quan sát trên quần thê tiêu cầu (quần thê dương tính với CD61).

-  Dùng các ống nhuộm anti mouse IgG làm chuẩn ngưỡng âm tính cho từng kênh màu và từng nghiệm ống mẫu xét nghiệm (ống 1 và 4 đê lấy chuẩn kênh mầu FITC và PE, ống 2 làm ngưỡng m cho ống 3, ống 5 làm ngưỡng m cho ống 6, ống 7 làm ngưỡng âm cho ống 8).

-  Nếu ống 3 có > 10% quần thê tiêu cầu khảo sát dương tính với anti human IgG: Kháng thê kháng tiêu cầu trực tiếp dương tính (có kháng thê trên bề mặt tiêu cầu người bệnh).

-  Nếu ống 6 có > 10% quần thê tiêu cầu khảo sát dương tính với anti human IgG: Hệ thống xét nghiệm tốt, chứng dương c òn hoạt động.

-    Nếu ống 8 có > 10% quần thể tiểu cầu khảo sát dương tính với anti human IgG: Kháng thể kháng tiểu cầu gián tiếp dương tính (có kháng thể kháng tiểu cầu tự do trong huyết thanh người bệnh).

Bình thường : Tất cả các ống đều âm tính với anti human IgG.

VI.NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

-    Sai sót mẫu bệnh phẩm: tên người bệnh trên giấy x ét nghiệm và trên ống mẫu không thống nhất, mẫu ống citrate natri bị đông, mẫu không ghi giờ lấy.

Xử trí: yêu cầu nơi đưa mẫu xác minh lại thong tin cần thiết, nếu mẫu bị đông phải lấy lại mẫu bệnh phẩm.

-    Không thấy quần thể dương tính với CD61 trên flow cytometry. Nguyên nhân có thể do kháng thể anti CD61 ké m chất lượng; kỹ thuật ly t âm tách tiểu cầu làm chưa đúng; kỹ thuật rửa tiểu cầu không đúng.

Xử trí: làm lại xét nghiệm và tuân thủ đúng quy trình.

-    Không thấy có quần thể tế bào khi chạy flow cytometry: có thể do máy không đủ áp lực; tắc kim hút, có bọt khí trong đường dẫn dịch.

Xử trí: Kiểm tra lại máy, nếu cần phải rửa máy, đuổi bọt khí và thong kim hút theo hướng dẫn đi theo máy.

TÀI LIỆ U THAM KHẢO

1.     Carolina Bonet Bub, Beatriz Moraes Martinelli, et al. Platelet antibody detection by flow cytometry: an effective method to evaluate and give transfusional support in platelet refractoriness. Rev Bras Hematol Hemoter. 2013; 35(4): 252-255.

2.     Beckman Coulter. 2011. Anti human CD61-PE Used manual

3.     Beckman Coulter. 2010. Anti human IgG-FITC Used manual

Beckman Coulter. 2011. Goat Anti Mouse IgG1-FITC Used manual