12-28-2015, 11:08 PM
NTM (Non Tuberculosis Mycobacteria) LPA
I. MỤC ĐÍCH VÀ NGUYÊN LÝ
1. Mục đích
Định danh các loại mycobacteria không phải M. tuberculosis thường gặp trong lâm sàng: M. avium spp; M. chelonae; M. abscessus; M fortuitum; M. gordonae; M. intracellulare; M. scrofulaceum; M. interjectum; M. kansasii; M. malmoense; M. peregrrinum; M. marinum/M. ulcerans; M. xenopi
2. Nguyên lý
Sử dụng kỹ thuật LPA (Line Probe Assay) để khuếch đại đoạn gene của chủng vi khuẩn NTB, sau đó lai với mẫu dò được thiết kế sẵn đặc hiệu cho từng loài Mycobacterium. Tùy theo đoạn gene của chủng NTM có trong bệnh phẩm lai đặc hiệu với mẫu dò nào thì sẽ xác định được tên của chủng NTB.
II. CHUẨN BỊ
1. Người thực hiện
- Người thực hiện Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.
- Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.
2. Phương tiện, hóa chất
Phương tiện, hóa chất như ví dụ dưới đây hoặc tương đương.
2.1. Trang thiết bị
- Tủ an toàn sinh học cấp 2
- Tủ thao tác PCR có đèn tím
- Máy ly tâm an toàn (có nắp đậy từng cối) cho tuýp 50ml
- Máy ly tâm lạnh cho tuýp 1.5ml
- Máy ủ nhiệt khô/ướt
- Máy siêu âm (Ultrasonic)
- Máy PCR
- Lò vi sóng (Microwave Oven)
- Bộ điện di
- Máy lai GT Blot 20
- Tủ lạnh 4oC và tủ lạnh - 20oC
- Nồi hấp khử trùng
- Tủ sấy
- Máy vortex
- Pipette tự động các loại 10P, 20P, 1000P
- Panh, kẹp (Forceps)
- Máy ly tâm mini (Spin down)
- Đồng hồ hẹn giờ
2.2. Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)-
- GenoType Mycobacterium CM (thế hệ 1 )
- NALC
- Nước tinh sạch pha PCR mix
- NaOH
- Natri Citrat
- Thạch điện di
- TAE x50
- Ethidium Bromid
- Nước cất hai lần (ly tâm - Lai DNA)
- Tuýp Falcon 50 ml
- Đầu côn 10 µl
- Đầu côn 100 µl
- Đầu côn 1000 µl
- Eppendorf 0,2 ml
- Eppendorf 1,5 ml
- Pipette nhựa 5 ml
- Pipette nhựa 20 ml
- Găng tay
- Khẩu trang N95
- Khăn giấy
- Cồn 70°
- Bút MARKER
- Bút chì kim 2B
- Băng dính trong
- Nhãn mã vạch
- QC (nếu thực hiện) *
- EQAS (nếu thực hiện) *
* Ghi chú:
- Chi phí nội kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình nội kiểm (QC) là 1/10 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lượng ≥ 10 mẫu cho 1 lần tiến hành kỹ thuật).
- Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/200 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 2 lần/1 năm).
3. Bệnh phẩm
Thực hiện xét nghiệm GenoType Mycobacterium CM với chủng vi khuẩn nuôi cấy lao lỏng/đặc.
4. Phiếu xét nghiệm
Điền đầy đủ thông tin theo mẫu phiếu yêu cầu
III. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.
1. Lấy bệnh phẩm
Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh (Xem Phụ lục 2).
2. Tiến hành kỹ thuật
2.1. Xử lý mẫu bệnh phẩm
2.2. Tách chiết DNA
2.3. Phản ứng khuếch đại
2.4. Lai tự động trên máy GT-blot 20 hoặc GT48
IV. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
- Vùng đối chứng liên hợp: CC: phải xuất hiện băng tín hiệu
- Vùng đối chứng cho họ Mycobacteria- UC: xuất hiện băng tín hiệu cho tất cả các mycobacteria và vi khuẩn Gram (+) có G+C cao
- Vùng đối chứng cho giống Mycobacterium: GC: xuất hiện băng khi có mặt các thành viên của giống mycobacterium
- Các vùng khác: đặc hiệu với các mẫu dò cho từng loài đã đề cập trong phần nguyên lí.
Trong trường hợp không định danh được chủng vi khuẩn với GenoType Mycobacterium CM, sử dụng GenoType Mycobacterium AS kit để có thể định danh các mycobacterium hiếm gặp hơn trong lâm sàng (sẽ được trình bày trong quy trình về GenoType Mycobacterium AS)
V. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
[table=95][tr][td]Lỗi[/td][td]Giải thích[/td][/tr][tr][td]Các băng tín hiệu đều yếu kể cả băng CC[/td][td]-Kiểm tra thiết bị, hóa chất, nhiệt độ.-Nhiệt độ phòng quá thấp hoặc hóa chất không được đưavề đến nhiệt độ phòng.-Nhiệt độ ủ quá thấp-Lượng CON-C và/hoặc SUB-C không đủ-Hóa chất hết hạn[/td][/tr][tr][td]Các băng tín hiệu đều yếu hoặc không có, trừ băng CC[/td][td]-Kiểm tra thiết bị, hóa chất, nhiệt độ.-PNM và HotstarTaq DNA Polymerase rã đông quá nhiều lần (tối ưu 5-6 lần)-PNM, HotstarTaq DNA Polymerase và các thành phầnkhác của Master Mix bị gia nhiệt. Sử dụng hộp giữ lạnh.-Nhiệt độ ủ quá cao hoặc quá thấp-Độ thuần, tinh sạch trong qúa trình xử lý mẫu-Có chất ức chế trong quá trình tách DNA ảnh hưởng đếnquá trình nhân gene.-Kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di trên agarose 2%.Nếu không thấy có sản phẩm PCR thì lặp lại bước tách chiết DNA và PCR; Nếu xuất hiện băng mờ thì tănglượng mẫu DNA từ 5ml thành 8ml; Nếu các băng sảnphẩm PCR nhòe thì pha loãng lượng mẫu DNA.[/td][/tr][tr][td]Các băng được nhuộm mầu không đều[/td][td]-Thanh Strips không hoàn toàn ngập trong dung dịch lai-Lắc khay có vấn đề trong khi lai[/td][/tr][tr][td]Mầu nền bị đậm[/td][td]-Kiểm tra thiết bị, hóa chất, nhiệt độ.-CON-C và/hoặc SUB-C quá đậm đặc-Không đủ dung dịch rửa, bước rửa không sạch-Dung dịch rửa quá lạnh so với nhiệt độ phòng (25oC)-Phụ thuộc vào lượng DNA đem lai mà mầu nền có thể đậm hơn.-Trong trường hợp này thì ngắt SUB-D ngay khi cácbăng tín hiệu đã nhìn rõ để tránh bị nhòe băng.[/td][/tr][tr][td]Các yếu tố khác ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm[/td][td]-Nhiệt độ ủ sai- Dung dịch lai và nước rửa không được làm ấm và pha trộn trước khi thực hiện.- Nhiễm DNA trong bước tách chiết hoặc/và trong hóa chất sử dụng. Trong trường hợp các hóa chất PCR bị nhiễm thì mẫu đối chứng âm cũng xuất hiện băng.- Bị nhiễm bởi các giếng bên cạnh trong qua trình bổ sung dung dịch lai.[/td][/tr][/table]