Mycobacterium tuberculosis siêu kháng LPA

[tuyenlab]

Mycobacterium tuberculosis siêu kháng LPA

I. MỤC ĐÍCH VÀ NGUYÊN LÝ

1. Mục đích

Phát hiện sự có mặt của gene gyrA (mã hóa cho enzim DNA gyrase) độti bến tạo khả năng đề kháng fluoroquinolones (ofloxaxin và moxifloxacin), gene rRNA 16S (rrs) đột biến tạo khả năng đề kháng của các peptit aminoglycosides/cyclic (các thuốc tiêm capreomycin, viomycin/kanamycin, amikacin), gene embB (mã hóa enzim arabinosyl transferase) đột biến tạo khả năng đề kháng ethambutol của M. tuberculosis.

2. Nguyên lý

Kỹ thuật Genotype MTBDRsl dựa trên công nghệ LPA (Line Probe Assay) bao gồm kỹ thuật nhân gene (PCR) và gắn kết các đoạn gene sau khi được nhân lên vào màng lai (STRIP) đã gắn sẵn các mẫu dò chuyên biệt (oligonucleotide probes). Mẫu dò cho phép xác định vi khuẩn lao (Mycobacterium tuberculosis complex) có thể liên kết đặc hiệu với các đoạn gene được nhân lên từ các loài thuộc nhóm này.

II. CHUẨN BỊ

1. Người thực hiện
- Người thực hiện Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.
- Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.

2. Phương tiện, hóa chất

Phương tiện, hóa chất như ví dụ dưới đây hoặc tương đương.

2.1. Trang thiết bị

- Tủ an toàn sinh học cấp 2

- Tủ thao tác PCR có đèn tím

- Máy ly tâm an toàn (có nắp đậy từng cối) cho tuýp 50ml

- Máy ly tâm lạnh cho tuýp 1.5ml

- Máy ủ nhiệt khô/ướt

- Máy siêu âm (Ultrasonic)

- Máy PCR

- Lò vi sóng (Microwave Oven)

- Bộ điện di

- Máy lai GT Blot 20

- Tủ lạnh 4oC và tủ lạnh -20oC

- Nồi hấp khử trùng

- Tủ sấy

- Máy vortex

- Pipette tự động các loại 10P, 20P, 1000P

- Panh, kẹp (Forceps)

- Máy ly tâm mini (Spin down)

- Đồng hồ hẹn giờ

2.2. Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)

- MTBDRsl

- NALC

- Nước tinh sạch pha PCR mix

- NaOH

- Natri Citrat

- Thạch điện di

- TAE x50

- Ethidium Bromid

- Nước cất hai lần (ly tâm - Lai DNA)

- Tuýp Falcon 50 ml

- Đầu côn 10 µl

- Đầu côn 100 µl

- Đầu côn 1000 µl

- Eppendorf 0,2 ml

- Eppendorf 1,5 ml

- Pipette nhựa 5 ml

- Pipette nhựa 20 ml

- Găng tay

- Khẩu trang N95

- Khăn giấy

- Cồn 70°

- Bút MARKER

- Bút chì kim 2B

- Băng dính trong

- Nhãn mã vạch

- QC (nếu thực hiện) *

-EQAS (nếu thực hiện) *

* Ghi chú:

- Chi phí nội kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình nội kiểm (QC) là 1/10 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lượng ≥ 10 mẫu cho 1 lần tiến hành kỹ thuật).

- Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/200 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 2 lần/1 năm).

3. Bệnh phẩm

Thực hiện xét nghiệm MTBDRsl chủng vi khuẩn nuôi cấy lao lỏng/đặc.

4. Phiếu xét nghiệm

Điền đầy đủ thông tin theo mẫu phiếu yêu cầu

III. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.

1. Lấy bệnh phẩm

Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh.

2. Tiến hành kỹ thuật

2.1. Xử lý mẫu bệnh phẩm

2.2. Tách chiết DNA

2.3. Phản ứng khuếch đại

2.4. Lai tự động trên máy GT-blot 20

IV. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

V. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

Theo quyết định số 26 /QĐ-BYT ngày 03 tháng 01 năm 2013