NTM (Non Tuberculosis Mycobacteria) nuôi cấy môi trường đặc

[tuyenlab]

NTM (Non Tuberculosis Mycobacteria) nuôi cấy môi trường đặc

I. MỤC ĐÍCH VÀ NGUYÊN LÝ

1. Mục đích

Phát hiện các Mycobacteria không phải Mycobacterium tuberculosis bằng kỹ thuật nuôi cấy môi trường đặc.

2. Nguyên lý

Xác định Mycobacterum tuberculosis có trong bệnh phẩm dựa vào hình ảnh khuẩn lạc mọc trên môi trường đặc và được xác định khi các thử nghiệm khẳng định MTB cho kết quả âm tính.

II. CHUẨN BỊ

1. Người thực hiện
- Người thực hiện Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.
- Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.

2. Phương tiện, hóa chất

Phương tiện, hóa chất như ví dụ dưới đây hoặc tương đương.

2.1. Trang thiết bị

- Tủ an toàn sinh học cấp 2

- Máy li tâm đủ tiêu chuẩn an toàn sinh học, đủ lực li tâm (>= 3000g).

- Máy lắc

- Tủ lạnh

- Cân

- Đồng hồ phút.

- Kính hiển vi

- Nồi hấp

- Tủ ấm hoặc buồng ấm (35 - 380C)

2.2. Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)

- KH2PO4

- MgSO4

- MgCitrat

- Asparagin

- Glyxerol

- Malachite

- Na2HPO4

- Trứng gà

- Cồn 70o

- Nước cất

- NaOH

- NaCitrat

- NALC

- Dầu soi

- Cồn 95o

- Cacbol fuchsin

- HCL

- Phenol

- Methylen

- Thanh định danh Niacin

- Presept 2,5

- Microshiel

- Tuyp nắp xoáy vô trùng 50ml

- Lam kính

- Pipette Paster nhựa vô trùng

- Que phết đờm

- Giấy lau kính hiển vi

- Gạc lọc

- Bông thấm nước

- Bông mỡ

- Pipette nhựa 10ml

- Đầu côn nhựa loại 1ml

- Găng tay

- Tuýp thủy tinh trung tính nút xoáy

- Tuýp 18 x 24 mm

- Bô can

- Bình cầu 2000ml

- ống đong 500 ml

- ống đong 50 ml

- Phễu thuỷ tinh 500ml

- Cốc mỏ 500ml

- Cốc có mỏ 200 ml

- Chai thủy tinh trung tính 1000ml

- Hộp đựng tiêu bản

- Túi nilon loại 2 lớp chịu nhiệt hấp

- Túi rác vàng hủy vật liệu lây nhiễm

- Thùng rác có nắp

- Thùng vận chuyển vật liệu lây nhiễm

- Hộp đựng vật sắc nhọn

- Khay đựng bệnh phẩm

- Hộp vận chuyển bệnh phẩm

- Giá đựng tuýp

- Khay đựng môi trường

- Mũ

- Khẩu trang

- Găng tay xử lý dụng cụ

- Quần áo bảo hộ

- Dung dịch tẩy rửa dụng cụ

- Bút chì đen HB

- Bút bi

- Bật lửa

- Sổ lưu kết quả xét nghiệm

- Khăn lau tay

- Giấy trả kết quả xét nghiệm

- Nhãn mã vạch

- QC (nếu thực hiện) *

- EQAS (nếu thực hiện) *

* Ghi chú:

- Chi phí nội kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình nội kiểm (QC) là 1/10 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lượng ≥ 10 mẫu cho 1 lần tiến hành kỹ thuật).

- Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/200 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 2 lần/1 năm).

3. Bệnh phẩm

Đờm, dịch phế quản, phân, mủ, dịch não tủy, các loại dịch khác…

4. Phiếu xét nghiệm: Điền đầy đủ thông tin theo mẫu yêu cầu

III. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.

1. Lấy bệnh phẩm

Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh (Xem Phụ lục 1 và Phụ lục 4)

2. Tiến hành kỹ thuật

2.1. Chuẩn bị môi trường hóa chất

2.2. Xử lý bệnh phẩm,nhuộm soi, nuôi cấy

2.3. Định danh

2.4. Xử lý vật liệu lây nhiễm

IV. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

1. Kết quả nhuộm soi

AFB có hình ảnh trực khuẩn mảnh, hơi cong, bắt màu đỏ đứng riêng lẻ hay xếp đôi hoặc từng đám trên nền xanh.

Đếm số lượng AFB và ghi kết quả như bảng sau:

2. Kết quả cấy

- Kiểm tra nhiễm trùng: sau 24 - 48 giờ

- Kiểm tra sau 72 giờ: mặt môi trường khô, xoáy nắp tuýp tránh bay hơi làm khô môi trường

- Theo dõi trong vòng 7 ngày để phát hiện chủng Mycobacteria mọc nhanh

- Đọc kết quả cấy hàng tuần đến 8 tuần.

- Khuẩn lạc nhóm Mycobacteria không phải lao (NTM) dạng S trơn bóng,
nhày, có hoặc không sắc tố, có thể mọc nhanh trong vòng 7 ngày.

Quy định đánh giá kết quả

3. Phân biệt NTM với MTB

- NTM (Mycobacteria không phải lao): Niacin âm tính

- NTM: thử nghiệm TBcID cho kết quả âm tính

V. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

- Tỉ lệ soi âm cấy dương thấp: có thể do khử tạp quá mạnh (nồng độ hóa chất, thời gian tiếp xúc) làm chết NTM (NTM nhạy cảm với khử tạp hơn so với MTB).

- Tỉ lệ ngoại nhiễm cao: có thể tăng thể tích hoặc nồng độ hóa chất, không kéo dài thời gian khử nhiễm.

- Nhiễm chéo có thể xảy ra, đề phòng nhiễm chéo: mỗi mẻ chỉ Xử lý 6-8 bệnh phẩm không mở đồng thời các tuýp mẫu. Chia nhỏ lượng dung dịch khử nhiễm và dung dịch đệm, không chắt trực tiếp dung dịch khử nhiễm hay dung dịch đệm vào bệnh phẩm.

Theo quyết định số 26 /QĐ-BYT ngày 03 tháng 01 năm 2013