Qui trình nuôi cấy phân lập vi khuẩn Streptococcus suis

[tuyenlab]

1. Phạm vi áp dụng: phòng xét nghiệm vi sinh lâm sàng của bệnh viện, Trung tâm y tế dự phòng từ cấp trung ương, tỉnh, thành phố.

2. Giải thích từ ngữ:

Streptococcus suis là một loài liên cầu, sống cộng sinh phổ biến ở lợn, là tác nhân gây bệnh ở động vật (lợn là chủ yếu) nhưng cũng là tác nhân gây viêm màng não mủ, nhiễm khuẩn huyết, viêm khớp và viêm nội tâm mạc ở người. Bệnh lưu hành địa phương ở hầu hết các nước có ngành chăn nuôi lợn.

3. Nguyên lý:
S. suis là vi khuẩn Gram dương, kỵ khí tuỳ tiện, hình cầu hoặc hình trứng (oval), đứng đơn, nối đôi thành cặp hay tạo chuỗi ngắn.

Đa số các chủng vi khuẩn S. suis phát triển trên môi trường thạch máu cừu 5% trong điều kiện ủ 35-37[sup]0[/sup]C có 5% CO2 trong vòng 16-24 giờ, gây tan huyết môi trường dạng alpha (tan huyết không hoàn toàn).

Giống như S. pneumoniae, S. suis có vỏ polysaccarit bọc ngoài. Vỏ polysaccarit giúp vi khuẩn kháng lại sự thực bào và có tính kháng nguyên.

Đặc tính sinh hóa của S. suis còn có nhiều ý kiến khác nhau. Hiện tại, để tránh nhầm lẫn, khi đã phân lập được một chủng vi khuẩn nghi S. suis từ bệnh phẩm lâm sàng, để xác định là S. suis, các nhà vi sinh phải kết hợp việc xác định một số lượng tối thiểu các đặc tính sinh hóa với việc định typ huyết thanh kháng đặc hiệu với vỏ polysaccarit của vi khuẩn S. suis.

Dựa trên cấu trúc kháng nguyên của vỏ (capsul), cho đến nay người ta thấy S. suis có 35 typ huyết thanh khác nhau, ký hiệu từ 1-35. Trong số 35 typ huyết thanh, có 2 typ huyết thanh thường gây nhiễm trên người là typ 2, hãn hữu là typ 14. Trên lợn, bệnh cảnh lâm sàng thường gắn liền với typ 1 và typ 2. Xác định typ bằng các phản ứng sinh hóa đơn thuần có thể không chính xác vì các chủng Streptococcus khác nhau có thể có đặc tính giống nhau.

4. Phương pháp xét nghiệm xác định:

4.1. Cách lấy mẫu, bảo quản, vận chuyển bệnh phẩm

Mẫu bệnh phẩm được lấy tuỳ theo bệnh cảnh lâm sàng. Ở người, thường phổ biến là: dịch não tủy và máu.
Dịch não tủy:

Thời gian lấy mẫu: lấy càng sớm càng tốt ngay khi có chỉ định, khi bệnh nhân nhập viện và trước khi dùng kháng sinh cho bệnh nhân.

Số lượng (cho chẩn đoán vi sinh): 1 – 2 ml.

Nguyên tắc: bảo đảm vô trùng tuyệt đối dụng cụ lấy mẫu, đựng mẫu và quá trình thao tác.

Dụng cụ lấy mẫu dịch não tủy:

- Chất sát trùng da (cồn 70%, cồn iodine)

- Băng gạc vô trùng

- Kim chọc tủy: cỡ 22/3,5” cho người lớn; 23/2,5” cho trẻ em

- Syringe và kim

- Ống nghiệm nhựa (2ml) có nắp xoáy ngoài (vô trùng) đựng DNT

- Nhẵn dán lên ống nghiệm để điền các thông tin về bệnh nhân

- Hộp hay túi chứa mẫu để vận chuyển.

Máu:

Trong trường hợp bệnh nhân có sốt cao, nghi nhiễm khuẩn huyết, viêm màng não, viêm phổi cấp, dùng bơm kim tiêm vô khuẩn lấy ít nhất 3ml máu tĩnh mạch (trẻ nhỏ), 5ml đến 10ml (người lớn) cấy ngay vào bình canh thang não-tim (brain-heart infusion) hoặc trypticase soy có bổ sung máu động vật 5% và nên có chất chống hình thành áo máu 0,025% SPS (sodium polyanethole sulfonate) và chất hấp phụ kháng sinh resins (nếu có), tỷ lệ máu cấy vào canh thang là 1 phần máu 10 phần canh thang. Hiện nay, do có các chai cấy máu của các hãng thương mại pha chế sẵn và máy cấy máu tự động. Việc pha loãng máu trong canh thang nuôi cấy theo tỷ lệ 1/10 có tác dụng làm giảm các chất ức chế vi khuẩn hoặc kháng sinh có trong máu bệnh nhân.

Chú ý: động tác và quá trình lấy máu, cấy máu phải đảm bảo thật vô khuẩn trong một quy trình kín. Tốt nhất, kim lấy máu được nối trực tiếp vào bình môi trường qua một ống cao su hay plastic vô khuẩn. Sát trùng vị trí lấy máu bằng cồn iốt.

Dụng cụ lấy máu:
- Chất sát trùng da (cồn 70% hoặc cồn iodine)

- Bông, gạc vô trùng, băng nịt

- Syringe và kim (loại 10ml vô khuẩn)

- Ống đựng máu (nên dùng loại ống lấy máu cho mục đích làm công thức máu: đã có sẵn chất chống đông.

- Nhãn để điền các thông tin về bệnh nhân

- Hộp hay túi đựng mẫu để vận chuyển.

Bảo quản và vận chuyển mẫu bệnh phẩm:

Tốt nhất, nên xử lý bệnh phẩm (DNT) và cấy ngay (hoặc DNT hoặc máu) vào môi trường thích hợp.

Tránh tuyệt đối không để bệnh phẩm chịu tác động trực tiếp của ánh nắng mặt trời hoặc nhiệt độ quá nóng hay quá lạnh (dưới 0[sup]0[/sup]C).

Nếu bệnh phẩm không chuyển được trong ngày, có thể giữ bệnh phẩm ở nhiệt độ phòng hoặc 4-8[sup]0[/sup]C nhưng không quá 24 giờ và nên giữ trong môi trường bảo quản T-I (phụ lục).

4.2. Xác định trực tiếp

Dụng cụ và trang thiết bị

+ Bộ nhuộm Gram

+ Lam kính và lamen

+ Que cấy 1µl

+ Đèn cồn

+ Kính hiển vi

+ Máy Vortex (máy trộn)

Nhuộm soi trực tiếp:

Tạo tiêu bản dịch não tủy:

- Nếu thể tích > 1ml: ly tâm 2000 vòng/20phút (hoặc 3000 vòng/10 phút), hút dịch nổi sang một ống nghiệm khác, để lại 100µl – 200µl cặn, xục đều bằng pipet. Lấy 1 giọt ‘cặn’ dịch não tủy đặt lên 1 lam kính sạch, không dàn mà để khô tự nhiên. Nhuộm Gram quan sát bạch cầu đa nhân trung tính và hình thể S. suis có mặt bên trong hoặc bên ngoài bạch cầu (hình lưỡi mác nối đôi, bắt màu Gram dương [tím sẫm]).

- Nếu thể tích < 1ml: không phải ly tâm, trộn đều và lấy một giọt tạo tiêu bản và nhuộm soi như trên.

Đọc kết quả trong Phương pháp nhuộm Gram:

Vi khuẩn Gram dương: màu tím (tím gentian).

Vi khuẩn Gram âm: màu đỏ (đỏ Fucsin).

Các vi khuẩn thuộc loại Gram dương có chất protein kiểu ‘magic ribonucleat’. Chất này khi gặp những thuốc màu thuộc loại pararosanilin (như tím gentian) và chất iodine (lugol) kết lại thành một hợp chất không bị phá hủy bởi cồn. Do đó, khi dùng cồn để tẩy màu, những vi khuẩn Gram dương không bị ảnh hưởng.

Liên cầu lợn: hình trứng (oval) (nối đôi, hoặc đơn), màu Gram (+): xanh tím.

4.3. Nuôi cấy phân lập, định danh vi khuẩn

4.3.1. Nguyên vật liệu và trang thiết bị:

Môi trường và sinh phẩm cho nuôi cấy phân lập, định danh:

+ Thạch máu cừu 5% (hoặc máu động vật): thương phẩm (BD BBL Co.,) hoặc tự pha chế (phụ lục).

+ Canh thang giàu dinh dưỡng: trypticase soy (TSI) hoặc brain-heart infusion (BHI) bổ xung 5% Fildes Enrichment (BD BBL Co.,) hoặc 5% máu động vật (cừu, thỏ).

+ Bộ định nhóm huyết thanh Lancefield (là điều kiện cần nhưng cũng có thể không dùng nếu không có điều kiện).

+ Bộ phản ứng sixnh hóa (xác định một số đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn): tự pha chế (canh thang 6,5% NaCl; Voges-Proskauer; canh thang Trehalose; canh thang peptone 1% Salicin) hoặc bộ sinh phẩm API Rapid ID 20 Strep system (BioMérieux, Marcy l’Etoile, France).

+ Bộ kháng huyết thanh S. suis typ 1, 2, 1/2, và 14 (Copenhagen Serological Institute, Denmark).

Dụng cụ và trang thiết bị cho nuôi cấy phân lập:

+ Que cấy dung tích 1µl và 10µl

+ Ống nghiệm nhựa (cryotube và eppendorf để bảo quản mẫu và ly tâm)

+ Giá để ống nghiệm

+ Đĩa petri vô trùng d = 90mm

+ Pipet định lượng, đầu tip 10µl và 100µl

+ Đèn cồn

+ Kính hiển vi

+ Máy Vortex (máy trộn)

+ Máy ly tâm thường (4000 – 10.000 vòng)

+ Tủ ấm CO2 hoặc tủ ấm thường + bình kín (để đốt được nến).

4.3.2. Phương pháp nuôi cấy phân lập:

Dịch não tuỷ:

Sau khi dịch não tuỷ được ly tâm 2000 vòng/20’, sử dụng phần cặn (100 – 200 µl) trộn đều bằng pipet, cấy 0,05ml lên môi trường thạch máu cừu 5% và 0,05ml vào canh thang tăng sinh (TSI hoặc BHI bổ xung 5% máu cừu đã tách bỏ fibrin hoặc có 5% sản phẩm từ máu là Fildes enrichment), ủ 35 -37[sup]0[/sup]C/5%CO[sub]2[/sub]/16-24h. Quan sát khuẩn lạc trên môi trường thạch máu sau 16 đến 24 giờ: là những khuẩn lạc trắng xám, kích thước 0,5-1mm có quầng tan huyết alpha (tan huyết màu xanh), hoặc tan huyết rất nhẹ (chỉ thấy dưới đáy khuẩn lạc).

Nếu không thấy khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch, cần cấy chuyển từ canh thang tăng sinh lên các đĩa môi trường thạch máu 5% mới vào các ngày 2, 3, 5, và 7. Sau 7 ngày, nếu vẫn không mọc mới trả lời âm tính.

Máu:

Nếu bệnh nhân được nghi nhiễm khuẩn huyết hoặc bệnh nhân được chẩn đoán lâm sàng là viêm màng não nhưng đang sốt, nên lấy từ 3-5ml máu tĩnh mạch (trong điều kiện vô trùng) để cấy máu tìm vi khuẩn.

Máu được cấy với tỷ lệ 1 phần máu/10 phần canh thang trong canh thang Trypticase soy có bổ sung 5% máu cừu hoặc máu động vật khác và 0,025% SPS (sodium polyanethole sulfonate, là chất chống tạo áo máu và làm giảm tác dụng của các chất ức chế vi khuẩn có trong máu bệnh nhân), ủ 35-37[sup]0[/sup]C/5% CO[sub]2[/sub]/16-24h, hoặc trong chai cấy máu đi kèm tủ cấy máu (BACTEC PLUS).

Khi có dấu hiệu dương tính trong chai cấy máu, cấy chuyển lên môi trường thạch máu cừu 5%, ủ ở điều kiện 35-37[sup]0[/sup]C/5%CO2/ qua đêm.

4.3.3. Phương pháp xét nghiệm định danh (xác định) S. suis
Theo thứ tự nên làm những bước sau:

(1) Xác định nhóm huyết thanh Lancefield: theo hướng dẫn của Nhà sản xuất. S. suis thuộc nhóm D.

(2) Xác định đặc điểm sinh hóa: có hai cách

*Hoặc sử dụng các môi trường tự pha chế tại phòng thí nghiệm:

- Thạch Trypticase soy (TSA) 6,5% NaCL: S. suis không mọc

- Thử nghiệm Voges-Proskauer: âm tính [-]

- Canh thang Trehalose: màu vàng (sinh a xit [+])

- Canh thang 1% Salicin: màu vàng (sinh a xit [+])

(hoặc thay thế bằng phản ứng thủy phân esculin dương tính).

*Hoặc sử dụng bộ sinh phẩm API Rapid ID 20 Strep system (BioMérieux, Marcy l’Etoile, France): thực hiện theo hướng dẫn của Nhà sản xuất và đọc kết quả theo bảng điểm (S. suis thường đạt điểm xác định 99,8%).

(3) Các thử nghiệm xác định typ huyết thanh (phản ứng ngưng kết với kháng huyết thanh đặc hiệu).

Sau khi đạt các tính chất sinh hóa trên, chủng vi khuẩn S. suis phải được xác định typ huyết thanh đặc hiệu bằng thử nghiệm ngưng kết với kháng huyết thanh đặc hiệu. Các loại kháng huyết thanh thường dùng là typ 2, typ 1, typ 1/2 và typ 14. Trong đó typ 2 là typ chiếm đa số.

Phương pháp:

+ Gặt một số khuẩn lạc của nuôi cấy qua đêm (≥ 12 giờ) trên đĩa thạch máu cừu 5%, tạo huyền dịch trong NaCl 0,9% (nước muối sinh lý) có 0,5% formalin, đạt độ đục ≥ 1 Mc Farland (đục có thể thấy được bằng mắt), đặt lên lam kính sạch 1 giọt huyền dịch vi khuẩn (15 - 20µl).

+ Đặt 01 giọt kháng huyết thanh đặc hiệu typ bên cạnh (tương đương thể tích huyền dịch vi khuẩn).

+ Dùng tăm gỗ hay tăm nhựa trộn đều, kết quả được đọc trong vòng 1 phút.

+ Phản ứng ngưng kết dương tính khi: xuất hiện các hạt tủa và hỗn dịch trở nên trong.

Hoặc quan sát phản ứng ngưng kết dưới kính hiển vi: huyền dịch vi khuẩn (1µl) được trộn với kháng huyết thanh (1µl) và 1µl xanh methylen trên 1 lam kính, đậy lamen lên và soi dưới vật kính dầu để quan sát hiện tượng ‘phình vỏ’ của S. suis.

4.4. Tiêu chuẩn chẩn đoán xác định Streptococcus suis

Tương tự như với các loại vi khuẩn khác, chẩn đoán phòng thí nghiệm xác định vi khuẩn S. suis dựa vào :

- Tính chất khuẩn lạc trên môi trường thạch máu cừu 5%: khuẩn lạc tròn nhỏ (d: 0,5 – 1mm), bóng ướt, trắng xám, gây tan huyết dạng alpha.

- Hình thể vi khuẩn: hình trứng (oval), đứng đơn hay nối đôi, đôi khi tạo chuỗi ngắn, bắt màu Gram dương.

- Là S. suis theo tiêu chuẩn xác định sinh hóa. Có 2 cách xác định:

*Theo bảng điểm của bộ API Rapid ID 20 Strep (BioMérieux, Marcy l’Etoile, France)

*Theo bộ sinh hóa (tự pha chế)

+ Phản ứng VP : âm tính

+ Không mọc trong canh thang có 6,5% NaCl

+ Lên men Trehalose (sinh axit): màu vàng

+ Lên men Salicin (sinh axit): màu vàng (hoặc thay thế bằng phản ứng thủy phân esculin dương tính).

- Thuộc nhóm D trong hệ thống phân loại Lancefield.

- Typ huyết thanh : typ 2 hoặc các typ khác [typ 1, 14...] (nếu có điều kiện).

Hình thể vi khuẩn và khuẩn lạc S. suis trên thạch máu

4.5. Chú ý:

Vi khuẩn S. suis sẽ không mọc (không phát triển) khi:

- Môi trường thạch máu không đảm bảo chất lượng (máu loãng ít hồng cầu, để lâu, đổ mỏng).

- Bệnh nhân đã dùng kháng sinh trước khi bệnh phẩm được lấy.

- Bệnh phẩm được lấy không đạt yêu cầu.

5. Báo cáo kết quả (phiếu trả lời kết quả)

6. Kiểm soát chất lượng:

Để kiểm soát chất lượng cần đảm bảo:

- Có chủng vi khuẩn chuẩn (để kiểm soát chất lượng các điều kiện phân lập vi khuẩn từ bệnh phẩm).

- Môi trường nuôi cấy phân lập và sinh phẩm xác định phải còn hạn và được giữ theo đúng những yêu cầu về điều kiện bảo quản của Nhà sản xuất.

- Môi trường nuôi cấy phân lập và sinh phẩm xác định phải được kiểm tra chất lượng ngay sau khi nhận về hoặc ngay sau khi pha chế (đối với môi trường nuôi cấy phân lập).

- Đảm bảo các điều kiện phát triển của vi khuẩn trong quá trình ủ (nhiệt độ, khí trường…).

- Bệnh phẩm được lấy và bảo quản đúng cách.

- Có sổ sách ghi chép quá trình làm xét nghiệm (nhật k‎y phòng xét nghiệm).

7. Các yêu cầu về an toàn:

Tuân thủ các yêu cầu về an toàn sinh học cho người thực hiện và môi trường làm việc:

- Nơi thực hiện xử lý‎ mẫu phải được cách ly với khu vực bàn giấy văn phòng.

- Người thực hiện trong quá trình làm việc phải có quần áo, mũ, khẩu trang, găng tay y tế.

- Các dụng cụ (ăng cấy, pipet…) hoặc được đốt qua đèn cồn hoặc phải được ngâm trong dung dịch khử trùng ngay sau khi thực hiện hoặc bỏ ngay vào túi rác chuyên dụng.

- Lau dọn vệ sinh khử trùng khu vực xử lý mẫu bệnh phẩm bằng hóa chất thích hợp ngay sau khi kết thúc xét nghiệm.

8. Chất thải phát sinh và phương pháp xử lý (tóm tắt)

- Bệnh phẩm và/hoặc chất đựng bệnh phẩm, dụng cụ xét nghiệm dùng 1 lần: sau khi xét nghiệm xong phải được cho vào thùng khử trùng chuyên dụng để khử trùng trước khi thải bỏ.

- Môi trường nuôi cấy bệnh phẩm: sau khi đã có kết quả phân lập phải được tập trung vào các thùng đựng chuyên dụng để hấp sấy khử trùng.

9. Tài liệu tham khảo

1. C. Tarradas, A. Arenas, A. Maldonado, I. Luque, A. Miranda, and A. Perea. Identification of Streptococcus suis Isolated from Swine: Proposal for Biochemical Parameters. (1994). J. Clin Microbiol. Vol 32. No. 2: 578 -580.

2. Robert Higgins, Marcelo Gottschalk. Review Article: An update on Streptococcus suis Identification (1990). J Vet Diagn Invest 2: 249-252.
3. Yu-Tsung Huang, Lee-Jene Teng, Shen-Wu-Ho, Po-Ren Hsueh. Streptococcus suis infection. (2005). J Microbiol Immunol Infect. 38: 306-313.

4. Zhao-Rong Lun, Qiao – Ping Wang, Xiao-Guang Chen, An-Xing Li, Xing-Quan Zhu. Streptococcus suis: an emerging zoonotic pathogen. (2007). Lancet Infect Dis. 7: 201-09.

1. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy, phân lập liên cầu lợn:

1.1. Môi trường thạch máu 5%: TSA + 5% máu (cừu, ngựa, thỏ)

Thạch máu 5% là môi trường cơ bản được dùng để nuôi cấy cũng như xác định các tính chất của phế cầu (thử nghiệm optochin).

Tiêu chuẩn chất lượng:

Thạch máu 5% phải đảm bảo có màu đỏ tươi, nếu có màu đỏ đen (do cho máu vào khi thạch còn quá nóng) hoặc loãng (do tỷ lệ hồng cầu trong máu thấp), nên loại bỏ và pha chế lại.

Sau khi pha chế phải kiểm tra chất lượng của môi trường bằng cách cấy chủng chuẩn hoặc chủng đã được xác định là phế cầu (S. pneumoniae) lên đĩa thạch. Khuẩn lạc mọc lên có hình dạng nhỏ, dẹt, ướt, không màu, môi trường nuôi cấy xung quanh có màu xám xanh hoặc xanh ve do vi khuẩn gây tan huyết không hoàn toàn (kiểu alpha).

Cách pha chế môi trường thạch máu:

+ Cân TSA (Trypticase Soy agar) theo hướng dẫn của Nhà sản xuất.

Ví dụ: chuẩn bị 500ml thạch TSA, phải cân 20g TSA hoà trong 500ml nước cất (dùng bình có dung tích 1lít), đun nóng để hoà tan (hoặc sử dụng lò vi sóng). Hấp 121[sup]0[/sup]C/15phút, để nguội đến 50[sup]0[/sup]C, bổ xung 5% máu động vật (cừu, ngựa, hoặc thỏ) đã chống đông (tách hết sợi tơ huyết bằng bi thuỷ tinh) vào, lắc đều nhẹ nhàng rồi đổ đĩa (15ml/1 đĩa có d = 90mm), Khi thạch đã cứng và bay hết hơi nước, gói kín bằng nylon sạch hoặc sử dụng túi nylon để đựng, giữ ở 4[sup]0[/sup]C .

1.2. Cách pha chế môi trường vận chuyển và bảo quản (T-I Medium):

Môi trường T-I là môi trường 2 pha, thường được sử dụng như môi trường nuôi cấy ban đầu, bảo quản và vận chuyển một số loại vi khuẩn như phế cầu, não mô cầu và Haemophilus influenzae, nhất là từ bệnh phẩm dịch não tủy hoặc máu.

+ Sử dụng ống nghiệm có dung tích từ 10-20ml, có nút cao su và nút nhôm đậy ngoài.

+ Chuẩn bị dung dịch đệm cho cả 2 pha (lỏng và đặc): 1lít đệm MOPS.

0,1M, và pH 7,2 như sau: 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid: 20,93g, cho vào 700ml nước cất, điều chỉnh pH 7,2 bằng NaOH. Sau đó, bổ xung nước cất vừa đủ 1 lít.

+ Chuẩn bị pha đặc (solid phase):

Than hoạt tính (Activated charcoal): 2,0 g

Tinh bột (soluble starch) 2,5 g

Thạch (Agar – Difco) 10,0 g

Hòa tan trong 500ml đệm MOPS, sử dụng thanh nam châm và máy khuấy từ có nhiệt để làm tan agar và tinh bột. Khi đã tạo được huyền dịch, vẫn giữ môi trường trên máy khuấy từ có nhiệt, chia 2,5 – 5ml huyền dịch này vào các ống nghiệm, đậy ống nghiệm bằng giấy thiếc (aluminium foil), xếp vào lồng kim loại để hấp ướt 121[sup] 0[/sup]C/15 phút. Sau đó, nhấc cả lồng kim loại ra khỏi nồi hấp ướt, đặt nghiêng cho đến khi nhiệt độ ống nghiệm hạ thấp và môi trường thạch đã đông lại trong ống nghiệm ở vị trí nghiêng.

+ Chuẩn bị pha lỏng (liquid phase):

Tryptic soy broth 30,0 g

Gelatin (Difco) 10,0 g

Đệm MOPS 500ml

Đun nóng môi trường này để làm tan chảy gelatin và tránh sự vón cục, hấp ướt 121[sup]0[/sup]C/15 phút.

Nếu để cấy máu (vận chuyển bệnh phẩm là máu), khi môi trường này đã nguội, bổ xung thêm SPS 0,025% (250 mg SPS hoà tan trong 5ml MOPS, lọc vô khuẩn bằng filter có màng lọc kích thước 0,22).

Nếu có mục đích phát hiện H. influenzae từ bệnh phẩm, bổ xung thêm 1% thể tích của cả 2 pha yếu tố hỗ trợ phát triển là Iso VitaleX.

Chia vào mỗi ống nghiệm (đã chứa môi trường thạch nghiêng vừa được chuẩn bị ở trên) 2,5 – 5 ml. Đậy chặt nút cao su và vặn chặt nắp nhôm bên ngoài. Cất ở 4[sup]0[/sup]C. Môi trường vận chuyển và bảo quản 2 pha này có thể giữ để dùng trong 2 năm với điều kiện vặn chặt nút và giữ ở nhiệt độ 4[sup]0[/sup]C. Trước khi sử dụng, cần kiểm tra tính vô trùng của loạt môi trường và chất lượng của môi trường bằng cách cấy vào (hoặc không cấy) vài ống nghiệm chủng meningococci, ủ ở 35[sup]0[/sup]C. Nếu môi trường đạt cả 2 điều kiện (vô khuẩn và chủng meningococci mọc được), làm ấm lại môi trường bằng ủ ở 35 -37[sup]0[/sup]C hoặc để môi trường đạt tới nhiệt độ phòng (25 - 30[sup]0[/sup]C) trước khi cấy bệnh phẩm vào.

PGS. TS. Phan Lê Thanh Hương
Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương