12-15-2015, 11:42 AM
Vi khuẩn định danh giải trình tự gene
I. NGUYÊN LÝ
1. Mục đích
Định danh mọi căn nguyên vi khuẩn gây bệnh đến mức độ chi và hoặc loài.
2. Nguyên lý
Định danh chính xác các loại vi khuẩn dựa trên trình tự nucleotide đặc trưng của gene mã hóa cho 16S rRNA của vi khuẩn bằng kỹ thuật giải trình tự gene.
II. CHUẨN BỊ
1. Người thực hiện
- Người thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.
- Người nhận định và phê duyệt kết quả: cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.
2. Phương tiện, hóa chất
Phương tiện, hóa chất như ví dụ dưới đây hoặc tương đương.
2.1. Trang thiết bị
- Tủ an toàn Sinh học cấp 2
- Máy PCR
- Máy đọc điện di
- Máy giải trình tự gen
- Máy ly tâm 25000 x g
- Máy ủ nhiệt
- Máy vortex
- Máy ly tâm dùng cho tube 0,2 ml
- Micropipette
- Bộ lưu điện
2.2. Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)
- Bông
- Cồn
- Bơm kim tiêm
- Panh
- Khay đựng bệnh phẩm
- Hộp vận chuyển bệnh phẩm
- Tube đựng bệnh phẩm
- Găng không có bột (DNase-RNase free)
- Sinh phẩm chẩn đoán
- Khấu hao sinh phẩm cho kiểm tra lại
- Kit tách chiết DNA
- DNA marker
- Primer 1 (bộ primer đặc hiệu)
- Primer 2 (bộ primer đặc hiệu)
- Primer 3 (bộ primer đặc hiệu)
- Primer 4 (bộ primer đặc hiệu)
- Ống Eppendorf 1,5 ml
- Ống Eppendorf 0,2 ml
- Đầu côn 10 µl có lọc
- Đầu côn 30 µl
- Đầu côn 200 µl có lọc
- Đầu côn 1 ml có lọc
- Ethanol BDH
- Water-DEPC Treated
- Giấy thấm
- Giấy xét nghiệm
- Sổ lưu kết quả xét nghiệm
- Bút viết kính
- Bút bi
- Mũ
- Khẩu trang
- Găng tay
- Găng tay xử lý dụng cụ
- Quần áo bảo hộ
- Dung dịch nước rửa tay
- Cồn sát trùng tay nhanh
- Dung dịch khử trùng
- Khăn lau tay
- QC (nếu thực hiện) *
- EQAS (nếu thực hiện) *
* Ghi chú:
- Chi phí nội kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình nội kiểm (QC) là 1/10 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lượng ≥ 10 mẫu cho 1 lần tiến hành kỹ thuật).
- Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/200 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 2 lần/1 năm).
3. Bệnh phẩm
Chủng vi khuẩn nuôi cấy thuần.
4. Phiếu xét nghiệm
Điền đầy đủ thông tin theo mẫu phiếu yêu cầu
III. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.
1. Lấy bệnh phẩm
Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh.
2. Tiến hành kỹ thuật
- Tách chiết DNA tổng số
- Thực hiện PCR gene 16S ARN ribosome
- Điện di kiểm tra sản phẩm
- Giải trình tự gene
- Kiểm tra độ tương đồng DNA
IV. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
Sản phẩm PCR phải có một băng đặc hiệu duy nhất, rõ nét và không bị đứt gẫy. Trình tự DNA của gene đích được so sánh với các trình tự của gene mã hóa cho 16S rRNA có trên “Genebank” để định danh căn nguyên vi khuẩn cần xác định. Trình tự nucleotide phải có độ tương đồng ≥ 97 % mới có thể kết luận được đến mức độ chi và/hoặc loài.
V. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
- Trong trường hợp không có sản phẩm PCR, cần phải kiểm tra lại quá trình tách chiết DNA tổng số, chất lượng primers và master mix, và thực hiện lại.
- Nếu trình tự DNA bị nhiễu cần phải kiểm tra lại độ đặc hiệu của sản phẩm PCR hoặc quá trình chạy PCR sequencing bị nhiễm chéo.
Theo quyết định số 26 /QĐ-BYT ngày 03 tháng 01 năm 2013