[TH] Kỹ thuật nhuộm Hóa học tế bào

[tuyenlab]

4.4. Nhuộm esterase không đặc hiệu

4.4.1. Cơ chế: Trong điều kiện pH và nhiệt độ thích hợp, naphtol tự do được giải phóng từ cơ chất (ví dụ µ Naphtol ASD acetate) dưới tác dụng của men esterase của bạch cầu hạt và mono sẽ kết hợp với muối diazo (tan, không màu) để tạo thành một chất tủa và có màu (azo).

Tuy nhiên, có sự khác nhau giữa hoạt tính men esterase trong bạch cầu mono và bạch cầu hạt khi thêm NaF vào dung dịch nhuộm: men esterase trong bạch cầu mono bị mất hoạt tính (ức chế) gần như hoàn toàn, ngược lại, hoạt tính men esterase trong bạch cầu hạt hầu như không thay đổi. Chính vì đặc điểm này mà người ta sử dụng hai phương pháp nhuộm esterase không đặc hiệu là ức chế và không ức chế để phân định dòng hạt và mono.

4.4.2. Pha dung dịch nhuộm:

(1). Đệm Tris : -Tris: 2,43g

- Nước cất: 25ml

- Acid HCl 1N :18,5ml

- Nước cất vừa đủ 100ml

(2). Dung dịch cơ chất: - µ Napthol -AS acetate :10mg

-Dimethyl formamide : 0,3ml

Trộn 20ml (1) với (2) lắc đều, thêm một ít muối fast blue (»30mg). Dung dịch có màu vàng chanh, sau đó đem nhuộm ngay.

4.4.3. Quy trình nhuộm:

a. Không ức chế:

- Cố định bằng hơi formol 40%: 15 phút.

- Rửa dưới vòi nước chảy 30 giây, để khô tự nhiên.

- Ủ trong dung dịch nhuộm ở 37[sup]0[/sup]C :1 giờ.

- Rửa dưới vòi nước chảy 30 giây, để khô tự nhiên.

- Nhuộm Kernetrot :12 phút

- Rửa dưới vòi nước chảy 30 giây, để khô tự nhiên.

- Chú ý: tiêu bản phải được cố định ngay, càng sớm càng tốt kể từ khi lấy bệnh phẩm ra khỏi cơ thể.

b. Ức chế bằng NaF:

- Cố định bằng hơi formol 40% : 15 phút.

- Rửa dưới vòi nước chảy 30 giây, để khô tự nhiên.

- Ủ trong dung dịch nhuộm ở 37[sup]0[/sup]C :1 giờ.

(có thêm NaF vào dung dịch nhuộm: 5mg/ml)

- Rửa dưới vòi nước chảy 30 giây, để khô tự nhiên.

- Nhuộm Kernetrot : 12 phút.

- Rửa dưới vòi nước chảy 30 giây, để khô tự nhiên.

4.4.4. Đọc kết quả:

Các tế bào dương tính có hạt màu xanh thẫm trong bào tương. Trong phân loại leukemia cấp, khi đọc kết quả phải tính score.