[TH] Kỹ thuật nhuộm Hóa học tế bào

Hoá học tế bào là phương pháp khảo sát một số thành phần có chứa trong các không bào nằm trong bào tương của tế bào, dưới kính hiển vi quang học sau khi làm hiện màu bằng các thuốc nhuộm hoặc các cơ chất thích hợp.

1. Nguyên tắc chung

1.1. Tất cả các phương pháp nhuộm hoá học tế bào đều bao gồm ba giai đoạn:

1.1.1. Cố định: Ngoài mục đích cố định tế bào trên tiêu bản, đối với mỗi phương pháp nhuộm phải lựa chọn hoá chất cố định hợp lý để bảo tồn tối đa thành phần cần khảo sát: ví dụ các không bào mỡ trong nhuộm sudan đen, men peroxydase trong nhuộm peroxydase,...

1.1.2. Nhuộm: Dùng các thuốc nhuộm (sudan đen) hay các cơ chất (benzidin, µ naphtol AS acetat,...) để trực tiếp hoặc gián tiếp làm hiện màu các thành phần cần khảo sát.

1.1.3. Tạo nền: Dùng một thuốc nhuộm làm hiện màu hình thái tế bào (nhân và bào tương) trên tiêu bản. Màu nền phải có độ tương phản cần thiết để giúp quan sát thuận lợi các hạt dương tính trong mỗi phương pháp nhuộm.

1.2. Phải loại bỏ hết chất nhuộm hay cố định và để khô tiêu bản trước khi chuyển sang bước tiếp theo.

1.3. Đọc kết quả:

1.3.1. Đánh giá mức độ dương tính:

- Độ 0: Không có hạt bắt màu hoá học tế bào là (-)

- Độ 1: Các hạt bắt màu chiếm khoảng £ 1/3 bào tương tế bào là (+)

- Độ 2: Các hạt bắt màu chiếm khoảng >1/3 đến < 3/4 bào tương tế bào là (++)

- Độ 3: Các hạt bắt màu chiếm hết bào tương tế bào là (+++)

- Độ 4: Các hạt bắt màu chiếm hết bào tương và đè lên cả nhân tế bào là (++++)

2. Giá trị của hoá học tế bào:

- Hỗ trợ phương pháp hình thái học để xác định dòng, mức độ biệt hoá tế bào trong phân loại lơ xê mi cấp , hội chứng rối loạn sinh tuỷ và các bất thường khác.

- Trong một số trường hợp đặc biệt, hoá học tế bào giúp xác định một quần thể tế bào có phải blast hay không: ví dụ các microblast dòng hạt trên tiêu bản giemsa giống như lympho rối loạn hình thái.

3. Biểu hiện hoá học tế bào của một số dòng tế bào máu

Bảng 1.3: Phản ứng hóa tế bào của các tế bào máu

4.1. Nhuộm Peroxydase (Phương pháp cải tiến của Nguyễn Văn Tính):

4.1.1. Cơ chế: Dưới tác dụng của peroxydase, hydrogen peroxid (H[sub]2[/sub]O[sub]2[/sub]) sẽ giải phóng ra một oxy nguyên tử, oxy hoá cơ chất (benzidin) tạo chất tủa màu tương ứng trong bào tương bạch cầu:

4.1.2. Pha dung dịch benzidin 0,1%:

- Cồn tuyệt đối :10ml

- Nước cất vừa đủ 100ml

- Ô xy già [sub] [/sub](30 thể tích): vài giọt

Lắc đều, bảo quản ở nhiệt độ phòng xét nghiệm. Lắc trước khi sử dụng.

4.1.3. Quy trình nhuộm:

- Ngâm tiêu bản trong cồn formol 10%: 10 phút.

- Rửa dưới vòi nước chảy 30 giây, để khô tự nhiên.

- Nhuộm benzidin 1% : 2 - 3 phút.

- Rửa dưới vòi nước chảy 1 phút, để khô tự nhiên.

- Nhuộm giemsa 1/10 : 10-12 phút.

- Rửa dưới vòi nước chảy 1 phút, để khô.

4.1.4. Đọc kết quả:

Phương pháp nhuộm này cho các hạt dương tính màu vàng xỉn (gỉ sắt) trong bào tương tế bào. Tính số lượng tế bào dương tính trong tổng số 100 tế bào cần xem xét. Đối với leukemia cấp thì đó là 100 tế bào blast. Người ta chỉ quan sát để có nhận xét chung về mức độ dương tính chứ không cần thiết tính score trong phương pháp nhuộm peroxydase.

4.2. Nhuộm sudan đen

4.2.1. Cơ chế: Chất màu sudan đen có thuộc tính hoà tan trong lipid, người ta lợi dụng đặc điểm này để phát hiện thành phần lipid có trong tế bào.

4.2.2. Pha dung dịch sudan:

(1) : Sudan đen B : 0,1g

Cồn 96[sup]0[/sup] : 30ml

(2): Dung dịch Phenol :

Dung dịch phenol : 2,96ml

Na[sub]2[/sub]HPO[sub]4 [/sub]. 12 H[sub]2[/sub]O : 0,06g

Cồn 96[sup]0[/sup] : 6ml

Nước cất : 20ml

4.2.3. Quy trình nhuộm:

- Cố định tiêu bản bằng hơi focmol: 10 phút.

- Rửa dưới vòi nước chảy 30 giây, để khô tự nhiên.

- Nhuộm Sudan: 25 phút.

- Nhúng cồn 70[sup]0[/sup]: 1/ 2-1 phút.

- Rửa dưới vòi nước chảy 30 giây, để khô tự nhiên.

- Nhuộm giemsa 1/10: 12 phút.

- Rửa dưới vòi nước chảy 1 phút, để khô.

4.2.4. Đọc kết quả:

Các tế bào dương tính chứa các hạt, cục màu đen trong bào tương và thường chờm lên nhân, có khi che kín cả tế bào. Cách đọc kết quả giống như phương pháp nhuộm peroxydase.

4.3. Nhuộm PAS (Periodic Acid Schiff):

4.3.1.Cơ chế: Dưới tác động của periodic (HIO[sub]4[/sub]. 2H[sub]2[/sub]O), nhóm chức rượu của glycogen được chuyển thành aldehyt, sẽ tác dụng với thuốc thử schiff, cho hợp chất màu hồng tươi trong bào tương tế bào.

4.3.2. Pha dung dịch nhuộm:

a. Dung dịch periodic 1%:

- Nước cất : 100ml

b. Dung dịch schiff :

- Fuchsin basic: 0,5 g

- Nước cất: 100ml / 40-50 [sup]0[/sup]C.

- Lắc đều cho tan hết, để nguội, lọc.

- Thêm 0,9 ml acid HCl nguyên chất

- Thêm 0,5 g Na[sub]2[/sub]S[sub]2[/sub]O[sub]5[/sub]

Để trong tủ tối 24 giờ, dung dịch chuyển sang màu vàng nhạt .

Bảo quản trong lọ màu ở 4 [sup]0[/sup]C để dùng dần.

c. Dung dịch Hematoxyline:

(1): - Alun de kali : 25g

- Nước cất 350ml (đun sôi cho tan hết)

- Thêm 0,5g hematoxylin

(2): - Iodat kali (KIO[sub]3[/sub] ): 0,1g

- Nước cất: 50ml

Khi nào (1) đã nguội, trộn(1) và (2), sau đó cho thêm 100ml glycerin nguyên chất.

4.3.3. Quy trình nhuộm:

- Ngâm tiêu bản trong formol 10% : 10 phút.

- Rửa dưới vòi nước chảy 30 giây, để khô tự nhiên.

- Nhuộm periodic 1% : 10-15 phút.

- Rửa dưới vòi nước chảy 30 giây, để khô tự nhiên.

- Nhuộm schiff : 10-12 phút.

- Rửa dưới vòi nước chảy 30 giây, để khô tự nhiên.

- Nhuộm hematoxylin : 20 phút.

- Rửa dưới vòi nước chảy 30 giây, để khô tự nhiên.

4.3.4. Đọc kết quả:

Các tế bào dương tính có các hạt, cục màu đỏ tươi (màu hoa mười giờ) trong bào tương. Các tế bào dương tính lan toả (bào tương có màu đỏ tươi mịn, không có hạt) không có giá trị. Đọc kết quả giống như phương pháp nhuộm peroxydase.

4.4. Nhuộm esterase không đặc hiệu

4.4.1. Cơ chế: Trong điều kiện pH và nhiệt độ thích hợp, naphtol tự do được giải phóng từ cơ chất (ví dụ µ Naphtol ASD acetate) dưới tác dụng của men esterase của bạch cầu hạt và mono sẽ kết hợp với muối diazo (tan, không màu) để tạo thành một chất tủa và có màu (azo).

Tuy nhiên, có sự khác nhau giữa hoạt tính men esterase trong bạch cầu mono và bạch cầu hạt khi thêm NaF vào dung dịch nhuộm: men esterase trong bạch cầu mono bị mất hoạt tính (ức chế) gần như hoàn toàn, ngược lại, hoạt tính men esterase trong bạch cầu hạt hầu như không thay đổi. Chính vì đặc điểm này mà người ta sử dụng hai phương pháp nhuộm esterase không đặc hiệu là ức chế và không ức chế để phân định dòng hạt và mono.

4.4.2. Pha dung dịch nhuộm:

(1). Đệm Tris : -Tris: 2,43g

- Nước cất: 25ml

- Acid HCl 1N :18,5ml

- Nước cất vừa đủ 100ml

(2). Dung dịch cơ chất: - µ Napthol -AS acetate :10mg

-Dimethyl formamide : 0,3ml

Trộn 20ml (1) với (2) lắc đều, thêm một ít muối fast blue (»30mg). Dung dịch có màu vàng chanh, sau đó đem nhuộm ngay.

4.4.3. Quy trình nhuộm:

a. Không ức chế:

- Cố định bằng hơi formol 40%: 15 phút.

- Rửa dưới vòi nước chảy 30 giây, để khô tự nhiên.

- Ủ trong dung dịch nhuộm ở 37[sup]0[/sup]C :1 giờ.

- Rửa dưới vòi nước chảy 30 giây, để khô tự nhiên.

- Nhuộm Kernetrot :12 phút

- Rửa dưới vòi nước chảy 30 giây, để khô tự nhiên.

- Chú ý: tiêu bản phải được cố định ngay, càng sớm càng tốt kể từ khi lấy bệnh phẩm ra khỏi cơ thể.

b. Ức chế bằng NaF:

- Cố định bằng hơi formol 40% : 15 phút.

- Rửa dưới vòi nước chảy 30 giây, để khô tự nhiên.

- Ủ trong dung dịch nhuộm ở 37[sup]0[/sup]C :1 giờ.

(có thêm NaF vào dung dịch nhuộm: 5mg/ml)

- Rửa dưới vòi nước chảy 30 giây, để khô tự nhiên.

- Nhuộm Kernetrot : 12 phút.

- Rửa dưới vòi nước chảy 30 giây, để khô tự nhiên.

4.4.4. Đọc kết quả:

Các tế bào dương tính có hạt màu xanh thẫm trong bào tương. Trong phân loại leukemia cấp, khi đọc kết quả phải tính score.

4.5. Nhuộm phophastase kiềm bạch cầu

Muối phốt phát của µ naphtol dưới tác động của men phosphatase kiềm bạch cầu trong môi trường có ion magie sẽ giải phóng ra µ naphtol. µ
naphtol kết hợp với muối diazo (fast blue) tạo thành một sản phẩm azo tủa, có màu.

4.5.2. Pha dung dịch nhuộm:

- Dung dịch đệm:

+ Nước cất: 12,5 ml.

+ Acid HCl 1N : 41ml.

+ Nước cất vừa đủ 500 ml, pH = 8,07.

- Dung dịch cơ chất:

+ 40 mg µ naphtol phosphat.

+ 1, 2 ml N-N dimethyl formamide.

+ Lắc đều cho tan hết.

+ Thêm vào 200 ml dung dịch đệm TRIS.

+ Khi nhuộm cho thêm vào hỗn dịch trên một ít muối fast blue sao cho hỗn dịch có màu xanh hơi nhạt.

- Dung dịch Kernetrot:

+ Nuclear fast red: 0,2g.

+ Al[sub]2[/sub](SO[sub]4[/sub])[sub]3[/sub] : 5 g.[sub] [/sub]

+ Nước cất: 100ml

Đun nóng để Al[sub]2[/sub](SO[sub]4[/sub])[sub]3 [/sub]tan hết trong nước cất, sau đó cho nuclear fast red vào để 5 phút, để nguội, thêm vào vài hạt thymol. Lọc trước khi sử dụng.

4.5.3. Kỹ thuật:

- Cố định tiêu bản máu và tuỷ bằng cồn focmol 10%: 15 phút.

- Rửa sạch, để khô.

- Ủ trong dung dịch nhuộm 1 giờ, 37 [sup]o[/sup]c.

- Rửa dưới vòi nước chảy, để khô.

- Nhuộm nền bằng dung dịch Kernetrot.

- Chú ý: tiêu bản phải được cố định ngay, càng sớm càng tốt kể từ khi lấy bệnh phẩm ra khỏi cơ thể.

4.5.4. Đọc kết quả:

Các tế bào dương tính có hạt màu xám đen trong bào tương. Tính score trong 100 tế bào cần xem xét.

Trong môi trường acid, ion sắt của ferritin (Fe[sup]+++[/sup]) sẽ tác dụng với ferrocyanide tạo ra ferric ferrocyanide có màu xanh phổ (xanh cobalt đậm).

4.6.2. Pha dung dịch nhuộm:

Trộn lẫn hai dung dịch sau theo tỷ lệ 1/2:

- Acid HCl 2% : 01 thể tích.

- Dung dịch Potasium Ferrocyanide (K[sub]4[/sub]FeCN[sub]6[/sub] . 3H[sub]2[/sub]O) 2% : 02 thể tích.

4.6.3. Kỹ thuật:

- Tiêu bản máu, tuỷ cố định bằng cồn metylic : 10 phút

- Rửa tiêu bản, để khô

- Nhuộm trong dung dịch nhuộm : 30 phút

- Nhúng trong acid HCl 1%,

- Nhuộm nhân bằng dung dịch Kernetrot : 12 phút

- Tiêu bản máu, tuỷ để khô & đọc kết quả

4.6.4. Đọc kết quả:

Các tế bào dương tính có hạt hoặc cục màu xanh phổ trong bào tương. Tính score trong tổng số 100 tế bào hồng cầu trưởng thành hoặc nguyên hồng cầu. Ngoài ra, cần tính tỷ lệ phần trăm tế bào nguyên hồng cầu sắt vòng.