02-21-2012, 11:16 AM
ĐỊNH LƯỢNG HUYẾT SẮC TỐ
(Phương pháp quang phổ kế)
1. Nguyên tắc:
Đo mật độ quang học của mẫu nghiệm sau khi đã chuyển huyết sắc tố thành methemoglobin - một dẫn xuất bền vững mà sự hấp phụ tốt nhất ở bước sóng 540 nm. Do mật độ quang tỷ lệ thuận với nồng độ của huyết sắc tố nên dễ dàng tính ra được lượng huyết sắc tố của mẫu nghiệm.
2. Máu xét nghiệm, thuốc thử và dụng cụ:
- Máu tĩnh mạch hoặc mao mạch chưa kịp đông hay đã được chống đông bằng EDTA khô 1,5mg/ml.
- Dụng cụ lấy máu mao mạch (đầu ngón tay) và tĩnh mạch.
- Dung dịch drabkin sử dụng.
- Hemo-trol chuẩn.
- Pipette vạch 20 ml (0,02 ml).
- Quang phổ kế có bước sóng 540 nm.
3. Kỹ thuật:
3.1. Thiết lập biểu đồ mẫu :
Làm bằng dung dịch chuẩn mà hiệu giá cyanmethemoglobin (bền vững trong điều kiện bảo quản ở 4[sup]0[/sup]C) đã được xác định chính xác và ghi rõ trên mỗi lọ mẫu chuẩn, thường khoảng 60 mg/100 ml, nghĩa là mật độ quang học tương ứng với một mẫu máu chứa lượng huyết sắc tố 15 mg/100 ml khi được pha loãng trong dung dịch drabkin (20ml/5ml). Để vẽ đường thẳng mẫu, người ta thực hiện trên một loạt ống nghiệm theo sơ đồ sau đây, trong đó tương ứng với hiệu giá của hemo-trol đã ghi chú:
![[Image: 8e4212b70b986e4019a874d3b54d40b0_41150356.od.jpg]](http://ni6.upanh.com/b4.s3.d2/8e4212b70b986e4019a874d3b54d40b0_41150356.od.jpg)
Đo mật độ quang học các ống nghiệm ở bước sóng 540nm, ghi trên giấy kẻ ô vuông milimet các mật độ quang học đọc được (OD[sub]1[/sub], OD[sub]2 [/sub],..., OD[sub]6 [/sub]) lên trục tung và lượng huyết sắc tố tương ứng tính được lên trục hoành (đơn vị g/l).
Cách tính lượng huyết sắc tố tương ứng từ mật độ quang đo được như sau:
Ví dụ, nếu tỷ lệ huyết sắc tố của hemo-trol chuẩn là 58 mg/100ml = 580g/l, thì:
Ống 1= 580 x 5: 20 = 145g/l.
Ống 5= 580 x 1: 20 = 29g/l.
Ống chứng = 0.
Nhờ có biểu đồ mẫu được thiết lập (một đường thẳng), đọc huyết sắc tố sẽ đơn giản bằng cách ghi mật độ quang học ở trục tung và suy ra lượng huyết sắc tố ở trục hoành tương ứng.
Trong điều kiện khó khăn, không thiết lập được biểu đồ mẫu hoặc vi môi trường phòng xét nghiệm không đảm bảo (không kín, không có điều hoà, không có hút ẩm) nên đo các mẫu nghiệm cùng với một mẫu hemo-trol chuẩn sau đó tính ra lượng huyết sắc tố cho mẫu nghiệm.
3.2. Đo mẫu xét nghiệm:
Chuẩn bị những ống nghiệm đựng 5ml dung dịch drabkin sử dụng. Cho vào mỗi ống 0,02 ml máu chưa kịp đông hoặc đã được chống đông khô, lắc thật đều, để khoảng 5 phút cho tan hoàn toàn hồng cầu. Đổ vào cóng của quang kế dung dịch drabkin sử dụng, điều chỉnh mật độ quang ở bước sóng 540 nm về số 0 (trừ trắng). Đổ dung dịch cần đo vào cóng, đo mật độ quang học ở bước sóng 540nm. Sau đó đối chiếu với biểu đồ mẫu hoặc dung dịch chuẩn (hemo-trol) để có tỷ lệ huyết sắc tố g/l.
4. Nguyên nhân sai số thường gặp:
- Độ pha loãng không chuẩn: hút máu hoặc dung dịch drabkin không đúng số lượng qui định.
- Hồng cầu chưa tan hết trong dung dịch drabkin: lắc không đều, thời gian quá ngắn.
- Huyết tương đục.
- Bạch cầu quá cao.
- Điện nguồn không ổn định hoặc quá thấp.
- Kính lọc mờ do hơi nước hoặc cũ.
- Dung dịch drabkin sử dụng không đúng nồng độ hoặc bị hỏng.
5. Các phương pháp khác:
5.1. Phương pháp máy đếm tế bào: Nguyên tắc đo huyết sắc tố của máy đếm tế bào cũng giống như phương pháp đo bằng quang phổ kế nói trên. Tuy nhiên, phương pháp máy đếm tế bào (kể cả máy tự động và máy bán tự động) tiện lợi và chính xác hơn nhiều. Xét nghiệm viên không cần chuẩn bị dung dịch chuẩn, không cần thiết lập biểu đồ mẫu, không cần pha loãng máu trong dung dịch drabkin.
5.2. Phương pháp đo trực tiếp bằng máu toàn phần: dựa trên sự chênh lệch cường độ ánh sáng phản xạ khi chiếu vào giọt máu toàn phần so với chuẩn trắng của máy đo. Phương pháp này gọn nhẹ về trang thiết bị, đơn giản về kỹ thuật, thích hợp cho công tác thực địa nhất là các vùng xa, vùng sâu; nhưng kết quả kém ổn định so với phương pháp quang kế.
5.3. Phương pháp so màu bằng mắt trên huyết sắc kế Sahli: Phương pháp này kém chính xác. Hiện nay không nên áp dụng.
