[SOPs] PHÂN TÍCH DẤU ẤN/CD/MARKER MIỄN DỊCH TỦY XƯƠNG BẰNG KỸ THUẬT FLOW CYTOMETRY

[tuyenlab]

PHÂN TÍCH DẤU ẤN/CD/MARKER MIỄN DỊCH TỦY XƯƠNG BẰNG KỸ

THUẬT FLOW CYTOMETRY (LÀM CHO 1 DẤU ẤN/CD/MARKER)

(Bone marrow or lympho node Immunophenotyping by flow cytometry)

I.    NGUYÊN LÝ

- Cùng với sự phát triển của tế bào tạo máu, các quần thể tế bào máu thuộc từng dòng khác nhau và các lứa tuổi khác nhau mang những đặc điểm dấu ấn miễn dịch (còn gọi là các marker hay các CD) khác nhau. Ví dụ CD45 là kháng nguyên bạch cầu chung, có trên bề mặt tất cả các tế bào bạch cầu trưởng thành. Ở giai đoạn non, bạch cầu có thể dương tính yếu hoặc âm tính với CD45. Các dấu ấn miễn dịch non khác như CD34, HLA-DR, TdT gặp ở những tế bào non. Các dấu ấn đặc trưng cho dòng tủy chung có CD13, CD33, CD15, CD117, MPO...; cho dòng mono có thêm CD14, CD16; cho dòng hồng cầu có thêm CD123a, CD71; cho d ò ng tiểu cầu có thêm CD41, CD61. Các dấu ấn miễn dịch đặc trưng cho dòng lympho B có CD10, CD19, CD20, CD22...; cho dòng lympho T có CD2, CD3, CD5, CD7, CD4, CD3, CD8....

-  Trên phân tích tế bào dòng chảy, tế bào tủy ủ với anti CD45 sau ly giải hồng cầu sẽ phân bổ trên đồ thị SS vs CD45 thành 3 vùng quần thể rõ rệt: vùng bạch cầu hạt, vùng mono, và vùng lympho.

-  Các quần thể tế bào blast ác tính thường xuất hiện trong vùng cửa sổ blast (trên đồ thị SS vs CD45), và/hoặc có các đặc điểm không đồng bộ về kháng nguyên (xuất hiện đ ng thời các kháng nguyên thuộc đặc trưng các d ng tế bào khác nhau, xuất hiện đồng thời các kháng nguyên thuộc các giai đoạn phát triển khác nhau của cùng 1 dòng tế bào), xuất hiện kháng nguyên quá mức, giảm hoặc mất biểu hiện một kháng nguyên nào đó. Trong quá trình biệt hóa, các tế bào máu có sự xuất hiện hoặc là mất đi các dấu ấn miễn dịch. Mỗi một dòng tế bào, một giai đoạn tế bào sẽ có những dấu ấn miễn dịch đặc trưng. Vì vây, có thể căn cứ vào sự có mặt hoặc không có mặt các dấu ấn miễn dịch có thể xác định được dòng tế bào và giai đoạn biệt hóa của tế bào ung thư trong Lơ xê mi cấp.

- Bằng cách sử dụng các kháng thể đơn dòng chống lại các dấu ấn miễn dịch đặc hiệu và phân tích trên máy Flow cytometry có thể phân tích được kiểu hình miễn dịch của một loại tế bào nào đó, xác định được tế bào ung thư máu thuộc d ng nào và giai đoạn biệt hóa nào.

II.      CHỈ ĐỊNH

-     Lơ xê mi cấp;

-     Lơ xê mi kinh;

-     Đa u tủy xương;

-     Rối loạn sinh tủy;

-     Rối loạn tăng sinh dò ng lympho;

-     U lympho không Hodgkin;

-     U lympho Hodgkin.

III.      CHỐNG CHỈ ĐỊNH

Không có chống chỉ định.

IV.      CHUẨN BỊ

1.      Người thực hiện

-     Kỹ thuật viên và cử nhân đã được đào tạo: thực hiện kỹ thuật.

-     Bác sỹ xét nghiệm: đọc kết quả, đánh giá, kiểm tra chất lượng.

2.      Phương tiện, hóa chất

2.1.      Phương tiện

-     Máy phân tích tế bào dò ng chảy (máy flow cytometer).

-     Máy ly tâm.

-     Máy lắc trộn.

-     Pipet man và đầu pipet loại 250 ul và 1.000 ul.

-     Ông nghiệm flow cytometry (chuyên dụng cho máy phân tích tế bào dòng chảy).

2.2.      Hóa chất chính

-    Anti CD45-PC5 (có thể sử dụng màu huỳnh quang khác như PerPC5.5, APC, ECD...).

-    Kháng thể kháng 1 CD định khảo sát có gắn mầu huỳnh quang khác với màu huỳnh quang của kháng thể anti CD45 (ví dụ CD33-PE).

-     Dung dịch ly giải hồng cầu.

-     Dung dịch sheath chạy máy flow.

-     Dung dịch đệm PBS.

2.3      Hóa chất, vật tư khác

-     Nước cất, hoá chất khử trùng Natri hypoclorite, găng tay.

3.      Bệnh phẩm

Là mẫu dịch hút tủy xương chống đông bằng EDTA, hoặc mẫu nghiền từ hạch. Mẫu được lấy từ các người bệnh nghi ngờ lơ xê mi cấp, u lympho hoặc các bệnh lý huyết học lành tính và ác tính khác.

V.      CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

1.      Lấy bệnh phẩm

-     1-2 ml dịch hút tủy xương chống đông bằng EDTA.

-     Trường hợp là mẩu sinh thiết hạch, cần khoảng bằng ^2 hạt gạo.

-    Mẫu cần được gửi đến phò ng xét nghiệm flow cytometry ngay trong vòng 6 giờ sau lấy mẫu.

2.      Tiến hành kỹ thuật

2.1.      Xử lý mẫu

-    Nếu là mẫu hạch: nghiền mẫu với 2 ml dung dịch PBS bằng dụng cụ nghiền mẫu. Sau nghiền đem lọc huyền dịch tế bào qua lưới nylon mịn để loại bỏ tổ chức xơ sợi. Chỉnh huyền dịch tế bào sau lọc về nồ ng độ khoảng 1 x 106 tế bào/ml.

-    Nếu là mẫu dịch hút tủy xương: Lọc dịch hút tủy xương qua lưới nylon mịn để loại bỏ tổ chức xơ sợi, mỡ, và các mảnh vụn xương (nếu có). Chỉnh huyền dịch tế bào sau lọc về nồ ng độ khoảng 1 x 106 tế bào bạc cầu/ml.

2.2.      Chuẩn bị mẫu

-     Lấy 100 pl mẫu đã chuẩn bị cho vào 1 ống nghiệm flow cytometry.

-    Ly giải hồng cầu bằng 1 ml dung dịch ly giải hồng cầu, ủ nhiệt độ phò ng trong 10 phút (với mẫu hạch không cần làm bước ly giải mà chuyển thẳng tới bước ủ kháng thể.

-    Ly tâm rửa huyền dịch tế bào sau ly giải hồng cầu 2 lần, mỗi lần làm như sau: thêm 3 ml dung dịch PBS vào ống flow cytometry, trộn lắc đều và ly tâm 2000 vòng/phút trong 3 phút. Đổ bỏ dịch nổi, để lại cặn tế bào và lượng dịch còn lại (khoảng 100 ul). Trộn đều cặn và lượng dịch còn lại.

2.3.      Ủ kháng thể

-    Cho kháng thể anti CD45-PC5, kháng thể kháng dấu ấn miễn dịch cần khảo sát (ví dụ CD33-PE) (mỗi loại 20 ul) vào ống flow cytometry chứa cặn tế bào đã phá hồ ng cầu ở bước trên. Trộn đều và ủ nhiệt độ phò ng 20 phút, tránh ánh sáng.

-    Rửa b ỏ kháng thể thừa: sau ủ, thêm 3 ml dung dịch PBS vào ống flow cytometry, trộn đều và ly tâm 2.000 vòng/phút trong 3 phút. Đổ b ỏ dịch nổi, để lại cặn tế bào.

-    Thêm 1 ml PBS vào ống cặn tế bào, trộn đều. Lúc này ống đã sẵn sàng cho phân tích.

2.4.      Phân tích trên máy flow cytometry

-     Đưa ống flow cytometry vào vị trí đọc trên máy.

-    Mở chương trình phân tích dấu ấn miễn dịch đa màu đã l ập sẵn trên máy. Nhập vị trí ống phân tích và chạy chương trình phần mềm phân tích.

VI.      NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

-    Quy ước: với mỗi một CD nếu tỷ lệ dương tính trên 20% thì được gọi là dương tính với CD đó.

-    Khi phân tích chủ yếu tập trung phân tích quần thể tế bào blast(nếu có). Trong một số trường hợp cụ thể (không phải bệnh máu ác tính), cần phân tích thêm các quần thể bạch cầu hạt, lympho, mono.

-    Nếu quần thể blast dương tính với các dấu ấn dò ng tủy như CD13, CD33... thì chẩn đoán là ung thư dòng tủy. Nếu dương tính với CD2, CD3, CD7, CD4, CD8... thì chẩn đoán là ung thư d ng lympho T. Nếu dương tính với các dấu ấn d ng lympho B như CD19, CD20, CD22, CD79a... thì chẩn đoán là ung thư dòng lympho B. Nếu chỉ dương tính với CD34 thì chẩn đoán là ung thư tế bào gốc tạo máu chưa phân thể.

-    Nếu không phải mẫu của người bệnh ung thư máu, tùy theo ý định của bác sỹ điều trị sẽ phân tích tỷ lệ % hoặc số lượng tuyệt đối (số tế bào/microlit) tế bào có mang một đặc điểm miễn dịch nhất định.

VII.       NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

-    Sai sót mẫu bệnh phẩm: tên người bệnh trên giấy x ét nghiệm và trên ống mẫu không thống nhất, mẫu bị đông, mẫu không ghi giờ lấy.

Xử trí: yêu cầu nơi đưa mẫu xác minh lại các thông tin cần thiết, nếu mẫu bị đông hoặc đã để quá l u th phải lấy lại mẫu bệnh phẩm.

-    Các tế bào bạch cầu nằm không đúng vùng tế bào trong cửa sổ chương trình chạy (Phải căn cứ vào đồ thị SS và CD45, căn cứ vào sự phân bổ rõ rệt của các quần thể tế bào trên đồ thị này và căn cứ vào quần thể tế bào lympho bình thường để xác định mức độ chồng lấp màu. Ở một mẫu máu bình thường, quần thể tế bào phân định thành 3 vùng rõ rệt là vùng bạch cầu hạt, vùng lympho và vùng mono). Nguyên nhân có thể do thực hiện không đúng, lượng kháng thể ủ không đủ, thực hiện không đủ các bước của quy trình, ủ không đủ thời gian, hút pipet không tốt, tắc kim hút trên máy...

Xử trí: Làm lại x ét nghiệm và tuân thủ theo đúng quy trì nh. Kiểm tra máy trước khi phân tích, phải rửa máy, đuổi bọt khí và thông kim hút (nếu cần) theo hướng dẫn đi theo máy.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1.   Beckman Coulter. 2011. IOTest CD45-PC5 Used manual.

2.   Beckman Coulter. 2011. IOTest CD3-PE Used manual.

3.   Beckman Coulter. 2011. IOTest CD33-FITC Used manual.

4.   Beckman Coulter. 2011. IOTest CD34-PE Used manual.

5.   Beckman Coulter. 2011. IOTest CD10-FITC Used manual.

6.   Beckman Coulter. 2011. IOTest CD117-PE Used manual.

J J M Van Dongen, L Lhermitte, S Bottcher, J Almeida, V H J van der Velden, J Flores-Montero et al. 2012. EuroFlow antibody panels for standardized n- dimensional flow cytometric immunophenotyping of normal, reactive and malignant leukocytes. Leukemia. 26, 1908-1975.

Nguồn: Quyết định 3336/QĐ-BYT ngày 20/7/2017 của Bộ trưởng Bộ Y tế về việc ban hành tài liệu Hướng dẫn quy trình kỹ thuật Huyết học - Truyền máu - Miễn dịch - Di truyền - Sinh học phân tử.