CÁC PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM CHẨN ĐOÁN NẤM GÂY BỆNH (Mycosis diagnosis).
PGS Nguyễn Ngọc Thụy
1. Phương pháp xét nghiệm trực tiếp.
1.1. Yêu cầu .
Xét nghiệm nấm gây bệnh cũng tương tự như xét nghiệm vi khuẩn gây bệnh. Những bệnh nhân nghi ngờ do nấm gây nên được tiến hành xét nghiệm trực tiếp soi dưới kính hiển vi hoặc được nuôi cấy trên các môi trường thích hợp để xác định tính chất sinh hoá học từ đó định rõ laòi nấm gây bệnh.
Trong công tác xét nghiệm nấm cần lưu ý điều kiện vệ sinh dụng cụ và không khí xung quanh ở nới làm xét nghiệm , vì trong không khí các bào tử và sợi nấm tạp thường xuất hiện. Nếu không chú ý vệ sinh sạch sẽ dễ lây nhiễm ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm.
Một số yếu tố có liên quan đến kết quả xét nghiệm.
+ Bệnh phẩm : trước khi làm xét nghiệm bệnh nhân phải ngừng thuốc điều trị kháng nấm ít nhất 1 - 2 tuần.
+ Nếu không ngừng thuốc thì nấm tạm thời " bién mất" " thể lặn" làm cho kỹ thuật viên tìm không ra.
+ Các thuốc mỡ tồn tại trên da khiến trong vi trường có nhiều hạt mỡ khó xem, làm cản trở tầm nhìn của người quan sát.
+ các thuốc màu làm cho da bị nhuộm mau, xanh hay tím, đỏ, làm che khuất cấu trúc của vi nấm.
+ Người quan sát soi phải có định hướng trên cơ sở tóm tắt của lâm sàng.
1.2. Xét nghiệm nấm ngoài da soi dưới kính hiển vi.
1.2.1. Bệnh phẩm để xét nghiệm trực tiếp nấm ngoài da có thể là tóc, lông,vẩy da đầu, vẩy da mặt, chan, tay, bụng, bẹn, kẽ chân, móng tay,v.v... vẩy da bệnh phẩm được lấy từ các nơi viêm nhiễm nghi có nấm, bệnh phẩm thường được lấy tại phòng xét nghiệm nấm.
1.2.2. Dụng cụ phương tiện.
Dao đầu nhọn, dao trích, kéo, kim, que cấy, phiến kính sạch, lame, gạc, bông cồn 70o C, đèn cồn để đốt. Kính hiển vi.
1.2.3. Dung dịch, hoá chất.
+ Dung dịch nhuộm gram để xét nghiệm trực tiếp nhuộm nấm hệ thống.
+ Dung dịch KOH 20% để xét nghiệm nấm da.
+ Để làm tiêu bản xét nghiệm được trong, giữ tiêu bản được lâu dài phục vụ xét nghiệm và huấn luyện thì dung dịch KOH có thêm glycerin theo công thức sau hoặc dung dịch DMSO.
Dung dịch KOH 20% :
- KOH 20 gam ; glycerin 20 ml + nước cất vừa đủ 100 ml.
- Dung dịch DMSO.
Nước cất 60 ml. KOH 20 gam. Dimetyslfoxide 40 ml.
1.2.4. Phương pháp tiến hành .
+ Lấy bệnh phẩm : dùng kính lúp có độ phóng đại từ 5-6 lần để quan sát nơi bị viêm nhiễm trên da tổn thương rồi dùng bông cồn 70o sát khuẩn qua để laọi trừ bụi, chất bẩn. Sau dùng dao đã hơ vô trùng trên ngọn đèn cồn, cạo lấy vẩy da hay chất sừng vào phiến kính sạch cũng đã được hơ trên ngọn đèn cồn, lấy bệnh phẩm, nếu là tóc, lông thì dùng kéo để cắt, rồi cắt tóc hoặc lông ngắn độ khoảng 0,1-1 cm dồn bệnh phẩm vào giữa phiến kính.
+ Khi lấy bệnh phẩm xong ta nhỏ 1-2 giọt dung dịch KOH 20% vào giữa bệnh phẩm. Sau đặt lên trên bệnh phẩm 1 lame sạch vô trùng, dùng đầu mũi dao ấn nhẹ xuống lame để dàn đều bệnh phẩm trên lam kính, để nhiệt độ phòng 45 phút rồi soi hoặc hơ phiến kính bệnh phẩm trên ngọn đèn cồn, ta hơ đi hơ lại nhẹ nhàng cho nóng, không sủi bọt rồi để nguội sau đem soi.
Chú ý : khi soi quan sát bệnh phẩm phải đều khắp các vi trường để tìm sợi nấm. Sợi nấm , đoạn sợi nấm hay bào tử đốt có thể bộc lộ trên các đám tế bào sừng của tổ chức da hoặc đứng riêng rẽ tách rời khỏi tế bào da, cần phân biệt sợi nấm với các sợi khác. Sợi nấm thường cong queo, ngoằn ngoèo mềm mại có khi phân nhánh và chiết quang hơn, thành sợi nấm thường dầy trông giống sợi " miến ăn".
+ Trả lời kết quả :
- Soi có sợi nấm, đoạn sợi nấm hoặc có bào tử nấm.
- Hoặc : không thấy sợi nấm, đoạn sợi nấm hoặc không thấy có bào tử nấm.
Trường hợp cần xác định loài nấm thì phải nuôi cấy phân lập rồi định danh loài nấm.
1.3. Xét nghiệm trực tiếp nấm " hệ thống".
Nấm hệ thống thường là nấm men hay nấm sợi gây bệnh ở trong các tổ chức của cơ thể người, được lấy bệnh phẩm rồi nhuộm gram.
1.3.1. Lấy bệnh phẩm :
Phương tiện để xét nghiệm trực tiếp nấm hệ thống.
+ Kính hiển vi có vật kính dầu.
+ Dung dịch nhuộm gram gồm có 4 dung dịch sau:
- Dung dịch 1 : crystalviolet
. Crystalvioet 2%.
. Cồn etylíc 20%.
. Oxalátamonium 0,8%.
- Dung dịch 2: Lugol.
. Iod 1,3%.
. KI 2%.
. Polyvinylpyrrolydon 10%.
- Dung dịch 3 :Alcol.
. Alcohol etylic 95% .... 50%.
. Aceton.........................50%.
- Dung dịch 4 : Safranine
. Safranine.......... 0, 25%.
. Alcohol 95.........10 %.
Dầu bách hương để soi và xy len để lau tiêu bản.
Thường do các khoa lấy bệnh phẩm trực tiếp từ bệnh nhân gửi đến phòng xét nghiệm nấm trong các dụng cụ tăm bông, ống nghiệm, phương tiện đã vô trùng. Bệnh phẩm có thể là đờm, dịch niêm mạc lưỡi, dịch họng, dịch phế quản, mủ tai, dử mắt, dịch não tuỷ, phân, dịch âm đạo, niệu đạo , máu hoặc ở các nơi viêm nhiễm khác ở các tổ chức trong cơ thể hay ở ngoài da.
1.3.2. Làm tiêu bản :
Dùng que bông hoặc que cấy có bệnh phẩm phết lên lam kính sạch đã hơ vô trùng trên ngọn đèn cồn ( để khô cố định ở nhiệt độ phòng).
Chú ý : phết thành một lớp mỏng đều trên phiến kính với đường kính khoảng 0,5 - 1 cm.
1.3.3. Sau khi tiêu bản bệnh phẩm được cố định xong ở nhiệt độ phòng hoặc hơ trên ngọn đèn cồn cố định bằng nhiệt hoặc cồn metilic thì ta tiến hành nhuộm theo phương pháp nhuộm gram như nhuộm vi khuẩn: nhỏ 1 giọt dung dịch số 1 để 1 phút, rửa nước, cho 1-2 giọt dung dịch số 2 để 1 phút rồi tráng nước, sau đó nhỏ vài giọt dung dịch 3, tráng tiêu bản bằng nước sạch, tiếp theo nhỏ 1-2 giọt dung dịch số 4 để yên 1 phút. Sau đó tráng tiêu bản cho hết màu đỏ, để khô tiêu bản rồi soi tìm nấm.
1.3.4. Kiểm tra soi tiêu bản bệnh phẩm và đánh giá kết quả.
Tiêu bản nhuộm xong để khô rồi soi dưới vật kính dầu, quan sát trên vi trường nếu thấy mấn men thường bắt mầu tím ( gram dương ) và có hình dạng là hình cầu, hình ô van, có khi thấy dạng mọc chồi với màu tím đậm. Nếu là sợi nấm thường là các đoạn sợi mềm mại, cong queo, có khi thấy bào tử nấm.
Chú ý : cần phân biệt với các tế bào khác có trong bệnh phẩm .
Trường hợp nghi ngờ thì phải chờ kết quả nuôi cấy. Trong xét nghiệm nấm hệ thống người ta rất lưu ý đến kết quả nuôi cấy vì theo kinh nghiệm cho kết quả cao hơn phương pháp soi trực tiếp. Trong thực tế người ta thường kết hợp 2 phương pháp.
(Sưu tầm)
PGS Nguyễn Ngọc Thụy
1. Phương pháp xét nghiệm trực tiếp.
1.1. Yêu cầu .
Xét nghiệm nấm gây bệnh cũng tương tự như xét nghiệm vi khuẩn gây bệnh. Những bệnh nhân nghi ngờ do nấm gây nên được tiến hành xét nghiệm trực tiếp soi dưới kính hiển vi hoặc được nuôi cấy trên các môi trường thích hợp để xác định tính chất sinh hoá học từ đó định rõ laòi nấm gây bệnh.
Trong công tác xét nghiệm nấm cần lưu ý điều kiện vệ sinh dụng cụ và không khí xung quanh ở nới làm xét nghiệm , vì trong không khí các bào tử và sợi nấm tạp thường xuất hiện. Nếu không chú ý vệ sinh sạch sẽ dễ lây nhiễm ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm.
Một số yếu tố có liên quan đến kết quả xét nghiệm.
+ Bệnh phẩm : trước khi làm xét nghiệm bệnh nhân phải ngừng thuốc điều trị kháng nấm ít nhất 1 - 2 tuần.
+ Nếu không ngừng thuốc thì nấm tạm thời " bién mất" " thể lặn" làm cho kỹ thuật viên tìm không ra.
+ Các thuốc mỡ tồn tại trên da khiến trong vi trường có nhiều hạt mỡ khó xem, làm cản trở tầm nhìn của người quan sát.
+ các thuốc màu làm cho da bị nhuộm mau, xanh hay tím, đỏ, làm che khuất cấu trúc của vi nấm.
+ Người quan sát soi phải có định hướng trên cơ sở tóm tắt của lâm sàng.
1.2. Xét nghiệm nấm ngoài da soi dưới kính hiển vi.
1.2.1. Bệnh phẩm để xét nghiệm trực tiếp nấm ngoài da có thể là tóc, lông,vẩy da đầu, vẩy da mặt, chan, tay, bụng, bẹn, kẽ chân, móng tay,v.v... vẩy da bệnh phẩm được lấy từ các nơi viêm nhiễm nghi có nấm, bệnh phẩm thường được lấy tại phòng xét nghiệm nấm.
1.2.2. Dụng cụ phương tiện.
Dao đầu nhọn, dao trích, kéo, kim, que cấy, phiến kính sạch, lame, gạc, bông cồn 70o C, đèn cồn để đốt. Kính hiển vi.
1.2.3. Dung dịch, hoá chất.
+ Dung dịch nhuộm gram để xét nghiệm trực tiếp nhuộm nấm hệ thống.
+ Dung dịch KOH 20% để xét nghiệm nấm da.
+ Để làm tiêu bản xét nghiệm được trong, giữ tiêu bản được lâu dài phục vụ xét nghiệm và huấn luyện thì dung dịch KOH có thêm glycerin theo công thức sau hoặc dung dịch DMSO.
Dung dịch KOH 20% :
- KOH 20 gam ; glycerin 20 ml + nước cất vừa đủ 100 ml.
- Dung dịch DMSO.
Nước cất 60 ml. KOH 20 gam. Dimetyslfoxide 40 ml.
1.2.4. Phương pháp tiến hành .
+ Lấy bệnh phẩm : dùng kính lúp có độ phóng đại từ 5-6 lần để quan sát nơi bị viêm nhiễm trên da tổn thương rồi dùng bông cồn 70o sát khuẩn qua để laọi trừ bụi, chất bẩn. Sau dùng dao đã hơ vô trùng trên ngọn đèn cồn, cạo lấy vẩy da hay chất sừng vào phiến kính sạch cũng đã được hơ trên ngọn đèn cồn, lấy bệnh phẩm, nếu là tóc, lông thì dùng kéo để cắt, rồi cắt tóc hoặc lông ngắn độ khoảng 0,1-1 cm dồn bệnh phẩm vào giữa phiến kính.
+ Khi lấy bệnh phẩm xong ta nhỏ 1-2 giọt dung dịch KOH 20% vào giữa bệnh phẩm. Sau đặt lên trên bệnh phẩm 1 lame sạch vô trùng, dùng đầu mũi dao ấn nhẹ xuống lame để dàn đều bệnh phẩm trên lam kính, để nhiệt độ phòng 45 phút rồi soi hoặc hơ phiến kính bệnh phẩm trên ngọn đèn cồn, ta hơ đi hơ lại nhẹ nhàng cho nóng, không sủi bọt rồi để nguội sau đem soi.
Chú ý : khi soi quan sát bệnh phẩm phải đều khắp các vi trường để tìm sợi nấm. Sợi nấm , đoạn sợi nấm hay bào tử đốt có thể bộc lộ trên các đám tế bào sừng của tổ chức da hoặc đứng riêng rẽ tách rời khỏi tế bào da, cần phân biệt sợi nấm với các sợi khác. Sợi nấm thường cong queo, ngoằn ngoèo mềm mại có khi phân nhánh và chiết quang hơn, thành sợi nấm thường dầy trông giống sợi " miến ăn".
+ Trả lời kết quả :
- Soi có sợi nấm, đoạn sợi nấm hoặc có bào tử nấm.
- Hoặc : không thấy sợi nấm, đoạn sợi nấm hoặc không thấy có bào tử nấm.
Trường hợp cần xác định loài nấm thì phải nuôi cấy phân lập rồi định danh loài nấm.
1.3. Xét nghiệm trực tiếp nấm " hệ thống".
Nấm hệ thống thường là nấm men hay nấm sợi gây bệnh ở trong các tổ chức của cơ thể người, được lấy bệnh phẩm rồi nhuộm gram.
1.3.1. Lấy bệnh phẩm :
Phương tiện để xét nghiệm trực tiếp nấm hệ thống.
+ Kính hiển vi có vật kính dầu.
+ Dung dịch nhuộm gram gồm có 4 dung dịch sau:
- Dung dịch 1 : crystalviolet
. Crystalvioet 2%.
. Cồn etylíc 20%.
. Oxalátamonium 0,8%.
- Dung dịch 2: Lugol.
. Iod 1,3%.
. KI 2%.
. Polyvinylpyrrolydon 10%.
- Dung dịch 3 :Alcol.
. Alcohol etylic 95% .... 50%.
. Aceton.........................50%.
- Dung dịch 4 : Safranine
. Safranine.......... 0, 25%.
. Alcohol 95.........10 %.
Dầu bách hương để soi và xy len để lau tiêu bản.
Thường do các khoa lấy bệnh phẩm trực tiếp từ bệnh nhân gửi đến phòng xét nghiệm nấm trong các dụng cụ tăm bông, ống nghiệm, phương tiện đã vô trùng. Bệnh phẩm có thể là đờm, dịch niêm mạc lưỡi, dịch họng, dịch phế quản, mủ tai, dử mắt, dịch não tuỷ, phân, dịch âm đạo, niệu đạo , máu hoặc ở các nơi viêm nhiễm khác ở các tổ chức trong cơ thể hay ở ngoài da.
1.3.2. Làm tiêu bản :
Dùng que bông hoặc que cấy có bệnh phẩm phết lên lam kính sạch đã hơ vô trùng trên ngọn đèn cồn ( để khô cố định ở nhiệt độ phòng).
Chú ý : phết thành một lớp mỏng đều trên phiến kính với đường kính khoảng 0,5 - 1 cm.
1.3.3. Sau khi tiêu bản bệnh phẩm được cố định xong ở nhiệt độ phòng hoặc hơ trên ngọn đèn cồn cố định bằng nhiệt hoặc cồn metilic thì ta tiến hành nhuộm theo phương pháp nhuộm gram như nhuộm vi khuẩn: nhỏ 1 giọt dung dịch số 1 để 1 phút, rửa nước, cho 1-2 giọt dung dịch số 2 để 1 phút rồi tráng nước, sau đó nhỏ vài giọt dung dịch 3, tráng tiêu bản bằng nước sạch, tiếp theo nhỏ 1-2 giọt dung dịch số 4 để yên 1 phút. Sau đó tráng tiêu bản cho hết màu đỏ, để khô tiêu bản rồi soi tìm nấm.
1.3.4. Kiểm tra soi tiêu bản bệnh phẩm và đánh giá kết quả.
Tiêu bản nhuộm xong để khô rồi soi dưới vật kính dầu, quan sát trên vi trường nếu thấy mấn men thường bắt mầu tím ( gram dương ) và có hình dạng là hình cầu, hình ô van, có khi thấy dạng mọc chồi với màu tím đậm. Nếu là sợi nấm thường là các đoạn sợi mềm mại, cong queo, có khi thấy bào tử nấm.
Chú ý : cần phân biệt với các tế bào khác có trong bệnh phẩm .
Trường hợp nghi ngờ thì phải chờ kết quả nuôi cấy. Trong xét nghiệm nấm hệ thống người ta rất lưu ý đến kết quả nuôi cấy vì theo kinh nghiệm cho kết quả cao hơn phương pháp soi trực tiếp. Trong thực tế người ta thường kết hợp 2 phương pháp.
(Sưu tầm)