Mycobacterium tuberculosis nuôi cấy môi trường lỏng

[tuyenlab]

Mycobacterium tuberculosis nuôi cấy môi trường lỏng

I. MỤC ĐÍCH VÀ NGUYÊN LÝ

1. Mục đích

Phát hiện Mycobacterium tuberculosis bằng kỹ thuật nuôi cấy môi trường lỏng.

2. Nguyên lý

Tube MGIT chứa môi trường lỏng Middlebrook 7H9 có oxy hòa tan và 1 hợp chất gồm: chất màu huỳnh quang, tris 4, 7-diphenyl-1, 10-phenonthroline ruthenium chloride pentahydrate được gắn vào lớp silicone ở đáy tube. Khi vi khuẩn phát triển oxy bị tiêu thụ, nồng độ oxy giảm, chất màu huỳnh quang thoát ức chế sẽ phát quang trong tube MGIT, có thể quan sát bằng tia UV. Cường độ phát quang tương ứng với mức độ tiêu thụ oxy, tương ứng nồng độ vi khuẩn phát triển trong tube môi trường. Máy tự động giám sát sự phát quang 60 phút một lần. Vi khuẩn mọc càng nhiều càng tăng độ phát quang.

II. CHUẨN BỊ

1. Người thực hiện
- Người thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.
- Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.

2. Phương tiện, hóa chất

Phương tiện, hóa chất như ví dụ dưới đây hoặc tương đương.

2.1. Trang thiết bị

- Tủ an toàn sinh học cấp 2

- Máy li tâm đủ tiêu chuẩn an toàn sinh học, đủ lực ly tâm (>= 3000 g).

- Máy lắc: vortex

- Tủ lạnh

- Cân điện tử: max 220 g, d = 0,1 mg

- Đồng hồ phút

- Kính hiển vi

- Nồi hấp

- Hệ thống máy BACTEC- MGIT 960 hoặc 320

- Pipet loại 100-1000 l.

2.2. Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)

- MGIT tuýp loại 7 ml

- MGIT supplement - PANTA

- KH2PO4

- Na2HPO4

-Cồn 70o

- Nước cất

- NaOH

- NaCitrat

- NALC

- Dầu soi

- Cồn 95o

- Cacbol fuchsin

- HCL

- Phenol

- Methylen

- Thanh định danh nhanh ( SD, TBcID..)

- Presept 2,5

- Microshiel

- Lòng trắng trứng

- Lam kính

- Tuyp nắp xoáy vô trùng 50ml

- Pipette Paster nhựa vô trùng

- Chai thủy tinh trung tính 1000ml

- Que phết đờm

- Giấy lau kính hiển vi

- Bông thấm nước

- Đầu côn nhựa loại 1ml

- Găng tay

- Tuýp 18 x 24 mm

- Bô can

- Hộp đựng tiêu bản

- Túi nilon loại 2 loại chịu nhiệt hấp

- Túi rác vàng hủy vật liệu lây nhiễm

- Thùng rác có nắp

- Thùng vận chuyển vật liệu lây nhiễm

- Hộp đựng vật sắc nhọn

- Khay đựng bệnh phẩm

- Hộp vận chuyển bệnh phẩm

- Giá đựng tuýp

- Mũ

- Khẩu trang

- Găng tay xử lý dụng cụ

- Quần áo bảo hộ

- Dung dịch tẩy rửa dụng cụ

- Bút chì đen HB

- Bút bi

- Bật lửa

- Sổ lưu kết quả xét nghiệm

- Khăn lau tay

- Giấy trả kết quả xét nghiệm

- Nhãn mã vạch

- QC (nếu thực hiện) *

- EQAS (nếu thực hiện) *

* Ghi chú:

- Chi phí nội kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình nội kiểm (QC) là 1/10 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lượng ≥ 10 mẫu cho 1 lần tiến hành kỹ thuật).

- Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/200 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 2 lần/1 năm).

3. Bệnh phẩm

Đờm, dịch phế quản, phân, mủ, dịch não tủy, các loại dịch khác…

4. Phiếu xét nghiệm

Điền đầy đủ thông tin theo mẫu yêu cầu

III. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.

1. Lấy bệnh phẩm

Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh (Xem Phụ lục 1 và Phụ lục 4).

2. Tiến hành kỹ thuật

2.1. Chuẩn bị môi trường hóa chất

2.2. Xử lý bệnh phẩm, nhuộm soi, nuôi cấy

2.3. Định danh: soi định danh và định danh nhanh bằng sắc kí miễn dịch

2.4. Xử lý vật liệu lây nhiễm

IV. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

1. Kết quả nhuộm soi tìm AFB (hướng dẫn của Chương trình chống lao Quốc gia)

2. Kết quả cấy

- Kết quả cấy dương tính trung bình trong vòng 3 ngày đến 2 tuần: máy tự động đọc và báo kết quả dương tính bằng tín hiệu đèn đỏ và âm thanh, lấy tuýp cấy được máy báo dương ra khỏi máy để định danh.

- Kết quả cấy âm tính được máy báo bằng tín hiệu đèn xanh và âm thanh sau 6 tuần, lấy tuýp cấy được máy báo âm ra khỏi máy quan sát bằng mắt thường để phát hiện tube cấy dương (có cặn vụn) trước khi khẳng định cấy âm tránh bỏ sót các trường hợp cấy dương tính máy không phát hiện được do số lượng vi khuẩn mọc ít.

- Ngoài ra tube cấy máy báo âm tính có đầu vào nhuộm soi dương phải ly tâm lấy cặn nhuộm soi để kiểm tra kết quả.

3. Kết quả định danh

3.1. Soi định danh

Các tube cấy do máy báo dương hoặc quan sát bằng mắt thấy cặn vụn hút cặn làm tiêu bản nhuộm ZN soi định danh gặp các tình huống sau:

- AFB dạng cuộn thừng nghĩ đến M. tuberculosis (MTB)

- AFB hình thể vụn xếp thành đám nghĩ đến NTM

- AFB tạo dạng cuộn thừng lẫn AFB hình thể vụn: nghĩ đến mẫu cấy vừa có MTB vừa có NTM

- AFB dạng cuộn thừng lẫn vi khuẩn khác: mẫu cấy có MTB và ngoại nhiễm

- Không có AFB, có các vi khuẩn khác hoặc nấm mẫu cấy bị ngoại nhiễm

- Soi không thấy gì tiếp tục ủ ấm làm tiêu bản khác sau 3 ngày.

3.2. Định danh nhanh bằng sắc ký miễn dịch (SD, TBcID..)

Những tuýp cấy dương tiến hành soi AFB, định danh nhanh bằng sắc ký miễn dịch (SD, TBcID..) để khẳng định M. tuberculosis complex.

- M. tuberculosis complex có kết quả định danh MTB dương tính

- NTM có kết quả định danh MTB âm tính

V. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

Máu lẫn trong bệnh phẩm ảnh hưởng đến kết quả cấy, vì vậy các bệnh phẩm lẫn nhiều máu không nuôi cấy lỏng yêu cầu lấy bệnh phẩm khác. Trường hợp dịch lẫn ít máu (tuýp dịch phân thành 2 lớp: dịch trên máu dưới) gạn lấy phần dịch thêm nước cất để phá vỡ hồng cầu trước khi Xử lý.

Nhiễm chéo trong quá trình thao tác kỹ thuật: hạn chế nhiễm chéo bằng cách phân loại nguồn bệnh phẩm dịch, đờm, nghi MDR, người bệnh thường...để Xử lý thích hợp. Không cấy chuyển chủng không làm tiêu bản soi định danh cùng lúc Xử lý bệnh phẩm. Chia nhỏ hóa chất dung dịch đệm, thao tác nhẹ nhàng tránh tạo hạt mù, chắt dung dịch vào thành tuýp. Không mở đồng thời các tuýp mẫu Mỗi mẻ Xử lý 6 - 8 mẫu.

Tỷ lệ ngoại nhiễm cao: giảm ngoại nhiễm bằng cách: Xử lý mẫu càng sớm càng tốt. Mẫu bảo quản 2 – 8 0 C không quá 72 giờ, dịch dạ dày, nước tiểu Xử lý sớm trước 4 giờ kể từ khi lấy mẫu. Tuân thủ quy trình xử lý, nồng độ và thời gian tiếp xúc với hóa chất. Đảm bảo chất lượng môi trường, sinh phẩm, hóa chất, dụng cụ trong hạn và vô trùng.

Nhầm lẫn hành chính: Kiểm tra cẩn thận về hành chính từ khâu nhận bệnh phẩm, vào sổ, trả kết quả, tránh nhầm lẫn. Khi thao tác kỹ thuật xếp mẫu theo thứ tự, tuân thủ qui tắc để cách ô trống đầu tiên.

Theo quyết định số 26 /QĐ-BYT ngày 03 tháng 01 năm 2013