12-04-2015, 09:11 PM
KỸ THUẬT LAI TẠI CHỖ CÓ GẮN CHẤT MÀU (CISH )
I. NGUYÊN LÝ
Xét nghiệm lai tại chỗ sử dụng mồi dò DNA gắn digoxigenin gắn chất mầu diaminobenzidin (DAB) nhằm xác định tình trạng khuyếch đại gen Her-2/neu.
II. CHUẨN BỊ
1. Người thực hiện
- Bác sĩ giải phẫu bệnh – tế bào bệnh học: 01
- Kỹ thuật viên giải phẫu bệnh – tế bào bệnh học: 01
- Cử nhân sinh học (không bắt buộc): 01
2. Phương tiện, hóa chất
2.1. Phương tiện
+ Máy lai biến tính
+ Kính hiển vi quang học
+ Phiến kính, lá kính
+ Máy cắt lát mỏng
+ Lưỡi dao cắt lát mỏng
+ Tủ ấm 37o và 56o
+ Tủ lạnh
+ Ống hút
2.2. Hóa chất
+ Ezprep khử parafin
+ Dung dịch CC2 khử parafin
+ Proteaza
+ Nước bạc
+ Dung dịch SIL ISH DNP CHRC
+ RED ISH DIG FR
+ RED ISH DIG FR
+Thuốc nhuộm hematoxylin
+ Dung dịch Bluing
+ Bộ kít Her-2 và CEP17
+ Cồn (70o, 80o, 85o, 90o, 100o).
+ Xylen
+ Dung dịch rửa
III. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
- Mẫu mô được cắt mỏng 4 micromet, gắn lên phiến kính đã được tráng silan
- Cài đặt chương trình cho máy
- Dán nhãn và đặt phiến kính gắn mẫu mô đã cắt vào máy
- Khử parafin bằng EZprep
- Bộc lộ kháng nguyên bằng dung dịch CC2: 30 phút ở 90oC
- Xử lý proteaza: 16 phút
- Ủ mảnh cắt với 100 µl probe Her-2 và CEP17 trong 4 phút
- Biến tính DNA trong 20 phút ở 80oC
- Lai DNA trong 6 giờ ở 37oC
- Rửa bằng nước bạc trong 8 phút ở 72oC
- Ủ trong dung dịch SIL ISH DNP CHRC: 4 phút
- Ủ với RED ISH DIG FR: 24 phút
- Ủ với RED ISH DIG FR: 8 phút
- Nhuộm hematoxylin II trong 4 phút
- Nhuộm với dung dịch Bluing trong 4 phút
- Lấy mảnh cắt ra khỏi máy và làm sạch mảnh cắt
- Làm khô mảnh cắt trong 1 giờ ở 60oC
- Ngâm mảnh cắt trong xylen 3 phút x 2 lần
- Gắn lá kính và đọc kết quả.
IV. ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ
Đánh giá tỷ lệ Her-2/CEP17 bằng cách đếm tín hiệu Her-2 (màu đỏ) và tín hiệu NST17 (màu nâu vàng) trong 20 nhân tế bào ung thư xâm nhập.
+ Tỷ lệ Her-2/CEP17 < 1,8: không khuyếch đại
+ Tỷ lệ Her-2/CEP17 ≥ 2,2: có khuyếch đại
+ Tỷ lệ 2,5 < Her-2/CEP17 ≤ 5: khuyếch đại thấp
+ Tỷ lệ Her-2/CEP17 > 5: khuyếch đại cao
+ Tỷ lệ 1,8 ≤ Her-2/CEP17 < 2,2: khuyếch đại giáp biên, cần đếm lại hoặc đếm thêm trên 20 nhân tế bào u xâm nhập nữa.
Số lượng tín hiệu màu đỏ sẽ xác định số lượng nhiễm sắc thể 17 tùy theo số lượng là 1, 2 và 3 hoặc nhiều hơn tương ứng nhiễm sắc thể 17 đơn bội, lưỡng bội và đa bội.
V. NHỮNG VẤN ĐỀ THƯỜNG GẶP VÀ CÁCH KHÁC PHỤC
Theo Quyết định Số: 5199 /QĐ-BYT