12-02-2015, 11:49 PM
NHUỘM LIPIT TRUNG TÍNH VÀ AXIT
BẰNG SUNFAT XANH LƠ NIL (THEO DUNNIGAN)
BẰNG SUNFAT XANH LƠ NIL (THEO DUNNIGAN)
I. NGUYÊN LÝ
Nhuộm để phân biệt giữa các lipit trung tính và axit bằng một phẩm nhuộm phức tạp, sunfat xanh lơ Nil. Phẩm này còn có một lysochrom, đỏ Nil, nhuộm màu hồng các lipit ở trạng thái lỏng, ngoài ra còn có một chất màu bazơ, xanh lơ Nil nhuộm những vật thể có phản ứng axit.
II. CHUẨN BỊ
1. Người thực hiện
+ Bác sĩ giải phẫu bệnh – tế bào bệnh học: 01
+ Kỹ thuật viên giải phẫu bệnh – tế bào bệnh học: 01
2. Phương tiện, hoá chất
- Máy cắt lạnh đã ở trạng thái sẵn sàng hoạt động
- Dao sắc, thớt nhựa sạch, phẳng
- Bộ dụng cụ phẫu tích bệnh phẩm
- Phiến kính, lá kính sạch
- Bút chì mềm (để ghi tên tuổi Người bệnh, mã số tiêu bản trên phiến kính).
- Giấy thấm, gạc sạch
- Găng tay, khẩu trang, mũ, kính bảo vệ mắt và quần áo bảo hộ.
- Chổi lông mềm
- Gel cắt lạnh
- Gắn lá kính: glycerogel hoặc sirô Apathy.
- Cồn tuyệt đối
- Phẩm nhuộm sunfat xanh lơ Nil
III. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
1. Chuẩn bị
- Bệnh phẩm sau khi lấy ra từ BN được gửi ngay đến khoa giải phẫu bệnh – tế bào bệnh học.
- Kỹ thuật viên tiếp nhận, ghi các thông tin về Người bệnh vào sổ đăng ký và mã số Người bệnh.
- Ghi mã số của Người bệnh vào phiến kính và dán mã số vào hộp đựng bệnh phẩm.
2. Cắt lọc bệnh phẩm
- Bác sĩ giải phẫu bệnh – tế bào bệnh học quan sát bệnh phẩm, mô tả kỹ về loại bệnh phẩm, số lượng, đo kích thước, màu sắc, tính chất, mặt cắt… của bệnh phẩm, xác định vùng tổn thương cần lấy mẫu cắt lạnh.
- Động tác lấy bệnh phẩm phải nhẹ nhàng, tránh gây dập nát hay biến đổi do tác động cơ học.
- Không kẹp vào vùng định lấy mẫu xét nghiệm, không rửa mẫu mô.
- Dùng dao sắc cắt theo một hướng, sao cho đường cắt gọn, không bị dập nát
- Kích thước của mảnh mô được cắt tùy theo kích thước của vật gá mẫu bệnh phẩm của máy cắt lạnh, thông thường kích thước 1 x 1 x 0,2 cm.
- Số lượng mảnh cắt tuỳ từng trường hợp.
3. Làm lạnh mẫu bệnh phẩm và cắt mảnh mô
- Đặt mẫu bệnh phẩm vào gá đúc lạnh rồi đưa ngay vào vị trí tương ứng trên thanh làm lạnh (Cryobar) trong buồng làm lạnh của máy, phủ gel cắt lạnh, xoay khối Head tracter đặt lên trên khuôn đúc chứa bệnh phẩm rồi đóng kín cửa kính phía trên buồng máy, chờ cho đến khi khối bệnh phẩm đông cứng (có màu trắng).
- Mẫu mô sau khi đã đông cứng được cắt thành những lát thật mỏng. Bắt đầu cắt thô với độ dày từ 10-15 micromet để tạo mặt phẳng. Sau đó điều chỉnh độ dày lát cắt, cắt thành các mảnh có độ dầy 10µ. Quay máy cắt với nhịp độ vừa phải.
- Kết hợp với chổi lông mềm dàn mảnh mô lên phiến kính.
- Cố định mảnh mô: (để cấu trúc mô và tế bào giữ nguyên hình dáng và bắt màu thuốc nhuộm), sau khi lát cắt được dàn lên phiến kính, phải được cố định ngay bằng cồn tuyệt đối 95-96o hoặc cồn acetic-formol trong 20 giây và nhúng vào nước cất. Cắt 3 mảnh.
4. Nhuộm mảnh cắt
4.1. Pha phẩm nhuộm
Dung dịch sunfat xanh lơ Nil bão hoà trong nước 200 500ml
Axit sunfuric 0,5% 50ml
Đun sôi hỗn hợp trên trong 2 giờ trước khi dùng ở 60oC.
Dùng ngay trong 90 phút.
4.2. Nhuộm
+ Lấy một vài mảnh cắt, chiết xuất bằng aceton trong một giờ ở nhiệt độ trong phòng thí nghiệm.
+ Nhuộm các mảnh cắt đã được xử lý và chưa xử lý bằng chiết xuất trong dung dịch sunfat Xanh lơ Nil (điều chế như trong phương pháp Menschick), trong 30 phút ở nhiệt độ 70oC.
+ Rửa mạnh các mảnh cắt ở nước cất 70oC và gắn lá kính bằng glycerogel.
+ Cùng một lúc nhuộm các mảnh cắt đã được chiết xuất và không chiết xuất bằng đen Soudan B trong cồn 70o trong 30 phút ở nhiệt độ trong phòng.
+ Rửa nhanh trong cồn 700 và rửa nước cất, gắn lá kính bằng glycerogel.
IV. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
1. Các mảnh cắt nhuộm bằng sunfat Xanh lơ Nil
Trên các mảnh cắt không bị chiết xuất:
Photpholipit: xanh
Các lipit trung tính (triglycerit và cholesterit): đỏ
Axit béo tự do: đỏ thắm
Chú thích: Cholesterol và các sterol tự do khác không nhuộm. Sự chiết xuất làm tăng độ chính xác của sự khu trú các photpholipit do đã loại các lipit kỵ nước.
2. Các mảnh cắt nhuộm đen Soudan dùng để kiểm tra
Sự đánh giá các mảnh cắt bắt màu sunfat xanh lơ Nil chỉ có thể ứng dụng cho các chất mà tính chất lipit đã được chứng minh do bắt màu đen Soudan.
Theo Quyết định Số: 5199 /QĐ-BYT