11-27-2015, 11:22 AM
NHUỘM HYDROXIT SẮT (THEO HALE )
I. NGUYÊN LÝ
Phương pháp nhuộm dựa vào ái lực của sắt (hoá trị 3) với các nhóm axit. Cơ chế hoá học chính xác của hiện tượng gắn kết này vẫn còn chưa sáng tỏ. Tuy nhiên, hydroxit sắt dạng keo, ngay khi được cố định, sẽ có thể được phát hiện ở bước nhuộm thứ 2 với ferrocyanur kali (phản ứng sẽ cho màu xanh).
II. CHUẨN BỊ
1. Người thực hiện
Kỹ thuật viên giải phẫu bệnh – tế bào bệnh học: 02
2. Phương tiện, hóa chất
2.1. Phương tiện, hóa chất chung
- Dung dịch cố định bệnh phẩm.
- Cồn (70o, 80o, 95o , 100o).
- Xylen hay toluen.
- Nước cất 2 lần.
- Parafin.
- Sáp ong.
- Albumin + glyxerin.
- Máy đo độ pH điện tử.
- Máy chuyển bệnh phẩm tự động.
- Máy đúc khối parafin.
- Bàn hơ dùng điện.
- Máy cắt lát mỏng (microtome).
- Lưỡi dao cắt lát mỏng.
- Lò nấu parafin.
- Tủ ấm 37O và 560.
- Tủ lạnh.
- Điều hòa nhiệt độ.
- Tủ hốt phòng thí nghiệm.
- Nguồn cấp nước chảy.
- Bể nhuộm bằng thủy tinh.
- Bể thủy tinh đựng cồn, xylen.
- Hộp bằng thép không rỉ đựng parafin.
- Khuôn nhựa.
- Giá đựng tiêu bản (đứng và nằm ngang).
- Cốc đong loại 1000ml, 500ml, 100ml và 50ml.
- Ống hút bằng nhựa, quả bóp cao su hút hóa chất.
- Kẹp không mấu, kéo.
- Cân phân tích.
- Giấy lọc.
- Phiến kính, lá kính.
- Axit picric ngâm, làm sạch phiến kính.
- Bôm Canada hoặc keo gắn lá kính.
- Kính hiển vi 2 mắt để kiểm tra kết quả nhuộm.
- Kính phòng hộ, găng tay các loại, mặt nạ phẫu thuật, áo choàng phẫu thuật.
2.2. Phương tiện, hóa chất riêng biệt cho kỹ thuật
- Phẩm nhuộm (hoặc dùng phẩm nhuộm có sẵn của các hãng hoặc pha như hướng dẫn ở III.6.1 dưới đây): FeCl2, axit acetic đặc, đỏ nhân, Kernechtrot, sunfat nhôm.
III. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
1. Cố định
Bệnh phẩm được lấy ra khỏi cơ thể được cố định ngay trong dung dịch formol đệm trung tính 10% với tỷ lệ thể tích dung dịch cố định nhiều gấp 20 -30 lần thể tích bệnh phẩm. Thời gian cố định từ 2-12 giờ tuỳ theo mảnh bệnh phẩm to hay nhỏ.
Sau cố định, bệnh phẩm được thực hiện qua các khâu kỹ thuật sau:
2. Chuyển bệnh phẩm
3. Vùi parafin
4. Đúc khối parafin
5. Cắt và dán mảnh cắt
6. Nhuộm mảnh cắt
6.1. Chuẩn bị phẩm nhuộm
a. Dung dịch mẹ hydroxit sắt dạng keo
- Nước cất: 250 ml
- Clorua sắt (29%): 4,4ml
Thêm clorua sắt cho đến khi nước cất sôi lên.
Chờ cho dung dịch chuyển sang màu đỏ thẫm, để vào lạnh. Dung dịch được bảo quản tối đa trong 2 tháng.
b. Dung dịch làm việc
- Axit acetic đậm đặc: 5 ml
- Dung dịch mẹ: 20 ml
- Nước cất: 15ml
c. Đỏ nhân
- Kernechtrot: 0,5g
- Sunfat nhôm: 12,5g
- Nước cất: 250 ml
Hoà tan bằng cách đun nóng. Thêm ít tinh thể thymol. Bảo quản trong tủ lạnh.
6.2. Tiến hành kỹ thuật
1. Tẩy parafin các mảnh cắt bằng 3 bể toluen (xylen), mỗi bể 2 phút
2. Chuyển vào các bể cồn 100°, 95°, 80° mỗi bể 2 phút
3. Rửa nước
4. Nhúng mảnh cắt rất nhanh vào dung dịch axit acetic 12%
5. Không rửa; đặt các mảnh cắt vào trong dung dịch làm việc khoảng 1 giờ
6. Rửa trong 4 bể axit acetic 12% (3 phút mỗi bể)
7. Đặt mảnh cắt vào trong dung dịch Ferrocyanua Kali (2%) + HCl (2%)với thể tích bằng nhau, khoảng 20 phút
8. Rửa nước chảy rồi qua nước cất
9. Nhuộm nhân bằng đỏ nhân trong 3 – 10 phút
10. Rửa trong nước chảy, rồi nước cất.
11. Làm mất nước nhanh bằng cồn 95º và cồn tuyệt đối
12. Làm trong bằng 3 bể toluen sạch
13. Gắn lá kính như thường lệ
IV. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
Mucopolysaccarit axit: xanh đậm.
V. MỘT SỐ SAI SÓT VÀ CÁCH XỬ TRÍ
Ở pH 3,1 và 2,5, màu xanh cho biết hầu hết là các mucin axit (trừ một số nhóm sunphat hóa mạnh). Ở pH 1,0, chỉ các mucin axit sunphat hóa yếu có màu xanh, trong khi ở pH 0,2, mucin axit sunphat hóa mạnh lại bắt màu xanh.
Theo Quyết định Số: 5199 /QĐ-BYT