[TH] Kỹ thuật pha chế một số môi trường nuôi cấy vi khuẩn

[tuyenlab]

Các loại môi trường dùng trong xét nghiệm vi khuẩn được phân loại như sau:

- Phân loại theo thể:

+ Môi trường lỏng: Canh thang, nước pepton
+ Môi trường đặc: Có 1-2% thạch như thạch thường, thạch máu…
+ Môi trường mềm: Có 0,3-0,5% thạch

- Phân loại theo mục đích sử dụng:

1. Môi trường cơ bản

Môi trường cơ bản là môi trường có đủ các chất cần thiết cho đa số các loại vi khuẩn gây bệnh phát triển được. Môi trường này thường được dùng để nuôi cấy các vi khuẩn dễ phát triển. Sau đây là một số môi trường cơ bản:

1.1. Nước thịt

Công thức:
- Thịt bò, thịt lợn hoặc thịt trâu : 500 g.
- Nước cất: 1000 mL.

Pha chế:
- Chuẩn bị đủ dụng cụ: Nồi nhụm, ống đong, dao, mỏy xay thịt, cõn, giấy lọc… và cỏc thành phần để pha chế.
- Lọc hết gân, mỡ của thịt, xay hoặc băm nhỏ, cân 500 g
- Ngâm thịt vào 1000 mL nước cất, để tủ lạnh qua đêm.
- Đun từ từ cho tới sôi, vớt bọt khuấy đều. Duy trì sôi âm ỉ trong 1giờ, thỉnh thoảng khuấy đều.
- Lọc qua giấy lọc để loại trừ mỡ và bã thịt.
- Thêm nước cất cho đủ 1000 mL, dùng để pha chế môi trường
- Nếu chưa dùng ngay thì đóng chai hấp 1100C trong 30 phút rồi bảo quản ở tủ lạnh
- Nhận định kết quả: Nước thịt phải trong, không lắng cặn

[tuyenlab]

1.2. Canh thang thường

Công thức:
- Nước thịt: 1000 mL.
- Pepton bột: 10 g.
- NaCl tinh khiết: 5 g.
Nếu không có nước thịt thì thay bằng 5g cao thịt.

Pha chế


- Chuẩn bị đủ dụng cụ: ống nghiệm, bình cầu, cân, giấy lọc, đèn cồn…

- Cân, đong đủ các thành phần của môi trường vào bình cầu.

- Đun sôi, lắc đều cho tan hết các thành phần.


- Điều chỉnh pH 7,8- 8 bằng dung dịch NaOH 20% hoặc HCl.

- Hấp 120C 30 phút, để nguội cho lắng cặn.


- Chắt lấy phần nước trong, điều chỉnh pH 7,4- 7,6.

- Đun sôi lại rồi lọc qua giấy lọc.

- Đóng ống nghiệm môi ống 5 mL rồi hấp 110C 30 phút hoặc hấp trước rồi đổ ra ống nghiệm vô khuẩn.

Nhận xét kết quả:
Yêu cầu môi trường phải trong, màu vàng nhạt hoặc vàng sẫm, ống môi trường không quá nhiều hoặc quá ít.

[tuyenlab]

1.3. Thạch thường

Công thức:
- Nước thịt: 1000 mL (có thể thay bằng 5 g cao thịt).
- Pepton bột: 10 g.
- NaCl tinh khiết: 5 g.
- Thạch sợi: 20 g.

Pha chế:

- Chuẩn bị đủ đĩa petri, ống nghiệm, ống đong, bình cầu, cân, giấy lọc, đèn cồn, nồi nhôm và các loại hoá chất.

- Cân, đong đủ nước thịt và các thành phần của môi trường vào nồi, đun nóng cho tan.

- Điều chỉnh pH 7,8- 8 bằng dung dịch kiềm hoặc acid.

- Cho thạch sợi đã rửa sạch cắt nhỏ vào nồi

- Hấp 120C/30phút.

- Kiểm tra lại pH 7,4- 7,6.

- Lọc qua giấy lọc hoặc bông vào bình cầu khi môi trường còn nóng.

- Hấp 110C 30 phút.

- Đổ đĩa hoặc ống nghiệm khi nhiệt độ khoảng 500C.

Nhận xét kết quả:
Thạch tan đều, môi trường không cứng hoặc quá mềm, đĩa thạch không dày quá hoặc mỏng quá. ống thạch phải có phần chân
và lưỡi.

[tuyenlab]

2. Môi trường phong phú

Môi trường phong phú là môi trường có nhiều chất dinh dưỡng hoặc các vitamin và một số yếu tố phát triển khác. Môi trường này dùng để nuôi cấy vi khuẩn không hoặc khó phát triển trên các môi trường thông thường.

2.1. Canh thang máu

Canh thang máu được pha chế từ canh thang thường. Mỗi ống canh thang cho thêm XV- XX giọt máu thỏ hoặc máu cừu lấy bằng kỹ thuật vô khuẩn.

2.2. Thạch máu

Công thức:
- Thạch thường: 250 mL.
- Máu thỏ hoặc máu cừu: 15 ml

Pha chế:

- Chuẩn bị đủ dụng cụ: Bơm kim tiêm 20 mL vô khuẩn, ống nghiệm vô khuẩn, đĩa petri, đèn cồn và chất chống đông.

- Đun nóng chảy 250 mL môi trường thạch thường đựng trong bình cầu, để nguội 500C.

- Lấy 15 mL máu từ tim thỏ hoặc từ ống đã có sẵn cho vào bình thạch trên ngọn lửa đèn cồn.

- Lắc nhẹ bình cầu cho máu hoà đều trong môi trường.

- Đổ môi trường vào đĩa petri hoặc ống nghiệm, để ống nằm nghiêng cho thạch đông.

Nhận xét kết quả:
Yêu cầu môi trường phải có màu thạch đỏ tươi, thạch tan đều, đĩa thạch có độ dày vừa phải xấp xỉ 4 mm, ống thạch có chân, lưỡi.

[tuyenlab]

2.3. Canh thang huyết thanh và thạch huyết thanh
- Canh thang huyết thanh: 10 mL canh thang + XV giọt huyết thanh.
- Thạch huyết thanh: 10 mL thạch thường + XV giọt huyết thanh.
Kỹ thuật pha chế được tiến hành như canh thang máu và thạch máu.


3. Môi trường phân lập

Môi trường phân lập dùng để tách một chủng vi khuẩn ra khỏi những vi khuẩn khác hoặc thu một chủng vi khuẩn thuần khiết. Môi trường phân lập gồm:
- Môi trường không chọn lọc: Các vi khuẩn đều có thể phát triển được như môi trường thạch máu, thạch thường.
- Môi trường chọn lọc: Là môi trường để ưu tiên một loại vi khuẩn hoặc một nhóm vi khuẩn phát triển.

Môi trường này ngoài các chất dinh dưỡng cơ bản còn có một số chất đặc hiệu để kích thích vi khuẩn cần phân lập phát triển hoặc một số chất kìm hãm, ức chế sự phát triển của các vi khuẩn khác. Các chất ức chế thường sử dụng là thuốc nhuộm, muối mật, hoá chất, kháng sinh…
+ Môi trường ít chọn lọc: Trong các môi trường này có nồng độ thấp các chất ức chế như môi trường Mac conkey, xanh brillant…
+ Môi trường chọn lọc cao: Môi trường này có nồng độ cao các chất ức chế như môi trường SS, thạch kiềm…
Sau đây là một số môi trường phân lập:

3.1. Môi trường phân lập tụ cầu:

3.1.1. Môi trường Schapman

Công thức:
- Thạch thường: 1000 mL.
- NaCl tinh khiết: 65 g.
- Đường mannit: 10 g.
- Dung dịch đỏ phenol 1%: 3- 5 mL.
(Hoà tan đỏ phenol trong nước cất nóng 700C, lọc qua giấy lọc)

Pha chế:

- Chuẩn bị đủ dụng cụ: ống đong, bình cầu, cân, pipet, đĩa petri, đèn cồn, ống nghiệm vô khuẩn và các loại hoá chất.

- Cân, đong đủ các thành phần của môi trường.

- Đun sôi thạch thường, chỉnh pH 7,0- 7,2.

- Cho muối, đường mannit và dung dịch đỏ phenol vào môi trường thạch thường.

- Hấp 110C /30 phút.

- Đổ môi trường ra đĩa hoặc ống.


Nhận xét kết quả: Môi trường có màu hồng cánh sen, đĩa môi trường đủ độ dày, ống môi
trường có đủ độ nghiêng.

[tuyenlab]

3.2. Môi trường phân lập vi khuẩn đường ruột

3.2.1. Môi trường Istrati

Công thức:
-Thạch thường 1000 mL.
- Lactose 15 g.
- Mật bò khô 8 g.
- Natri citrat 8 g.
- Natri hyposunfit 8,5 g.
- Sắt II citrat 2 g.
- Xanh bromothymol 20- 40 mL.
Cách pha xanh bromothymol:
Cân 1g bromothymol cho vào cối sứ nghiền đều. Nhỏ từng giọt 25 mL NaOH
0,4%. Cho nước cất vừa đủ 500 mL, đóng vào lọ dùng dần.

Pha chế:
- Chuẩn bị đủ dụng cụ: Đĩa petri, pipet, cân

- Chuẩn bị thạch thường và các hoá chất cần thiết (MT đã cất giữ trong tủ lạnh).

- Cân đủ các thành phần và hoá chất cho vào bình thạch thường.

- Đun sôi bình thạch cho tan đều, chỉnh pH 7,2.

- Cho dung dịch xanh bromothymol, đun sôi thêm 10 phút.

- Để thạch nguội 45- 500C, đổ đĩa petri, bảo quản ở tủ lạnh.

- Nhận xét kết quả: Môi trường có màu xanh cỏ úa, mịn, độ dày vừa phải.

3.2.2. Môi trường Endo

Công thức:
- Pepton 10 g.
- K2HPO4 3,5 g.
- Natri sunlfit 2,5 g.
- Lactose 10 g.
- Thạch sợi 20 g.
- Dung dịch Fuchsin 10% trong cồn 900: 4 mL.
- Nước cất 1000 mL.

Pha chế:
- Chuẩn bị đủ dụng cụ: ống đong, bình cầu, nồi nhôm, pipet, đĩa petri, đèn cồn.

- Chuẩn bị các loại hoá chất.

- Cân, đong đủ các thành phần của môi trường vào nồi nhôm.

- Đun sôi cho các chất hoà tan.

- Điều chỉnh pH 7,6.

- Đóng bình cầu, mỗi bình khoảng 300 mL, hấp 1100C/ 20 phút.

- Để môi trường nguội 500C, đổ đĩa.

- Nhận xét kết quả: Môi trường có màu hồng nhạt, độ dày vừa phải không nứt, không mềm.


3.2.3. Môi trường SS (Salmonella- Shigella agar)

Công thức:
- Cao thịt: 5 g.
- Pepton: 5 g.
- Lactose: 10 g.
- Muối mật: 8,5 g.
- Natri citrat: 8,5 g.
- Sắt citrat: 1 g.
- Xanh brilan (dung dịch 0,1% trong nước): 0,3 mL.
- Đỏ trung tính (dung dịch 1% trong nước): 2,5 mL.
- Thạch: 20 g.
- Nước cất: 1000 mL.

Pha chế:
- Chuẩn bị đủ dụng cụ: ống đong, bình cầu, cân,
pipet, đĩa petri, đèn cồn

- Chuẩn bị đủ hoá chất dùng cho môi trường.

- Cân, đong đủ các thành phần môi trường vào
bình cầu.

- Đun sôi nhỏ lửa, lắc đều cho tan hết các chất.

- Điều chỉnh pH 7,0- 7,2

- Để nguội 500C, đổ đĩa petri.

- Nhận xét kết quả: Môi trường có màu hồng,
mịn, đĩa thạch có độ dày vừa phải, không nứt,
không mềm, không có nước.


3.2.4. Môi trường Macconkey

Công thức:
- Pepton : 20 g.
- Lactose: 10 g.
- Muối mật: 1,5 g.
- Natri clorid: 5 g.
- Thạch sợi: 20 g.
- Nước cất: 1000 mL.

Pha chế:
- Chuẩn bị đủ dụng cụ: ống đong, bình cầu,
cân, pipet, nồi nhôm, đĩa petri, đèn cồn.

- Chuẩn bị đủ hoá chất để pha chế môi trường.

- Cân, đong đủ các thành phần của môi trường cho vào nồi.

- Đun nhỏ lửa, khuấy đều cho tan các chất.

- Điều chỉnh pH 7,2- 7,4.

- Nhỏ tiếp 0,6 mL đỏ trung tính 1%, khuấy đều

- Phân phối vào bình cầu, hấp 1100C 30 phút .

- Để nguội 500C, đổ đĩa petri.



Nhận xét kết quả : Môi trường có màu hồng
sẫm, các đĩa thạch không có nước, đủ độ dày.

[tuyenlab]

3.3. Môi trường phân lập phẩy khuẩn tả.

3.3.1. Môi trường TCBS (Thiosulfate Citrate Bile Salts).

Công thức:
- Pepton : 10 g.
- Cao men: 5 g.
- Natri citrat: 10 g.
- Natri thiosulfat: 10 g.
- Mật bò khô: 5 g.
- Natri clorid: 10 g.
- Natri cholat: 3 g.
- Feric citrat: 1 g.
- Saccharose: 20 g.
- Dung dịch xanh thymol 1%: 4 mL.
- Dung dịch xanh bromothymol 0,2%: 20 mL.
- Thạch sợi: 15 g.
- Nước cất vừa đủ: 1000 mL.

Tiến hành
- Chuẩn bị đủ dụng cụ: ống đong, bình cầu, cân, pipet, đĩa petri, đèn cồn.
- Chuẩn bị đủ các loại hoá chất cần thiết cho việc pha chế môi trường.
- Pha dung dịch xanh bromothymol 0,2%: Cho 2,5 mL dung dịch NaOH 0,4% vào 47,5 mL nước cất rồi cho thêm 0,1 g xanh bromothymol.
- Pha dung dịch xanh thymol 1%: Cho 2,2 mL dung dịch NaOH 0,4% vào 7,8 mL nước cất rồi cho thêm 0,1 g xanh thymol.
- Cân, đong đủ các thành phần của môi trường cho vào bình cầu.
- Đun sôi, lắc đều cho tới khi tan hoàn toàn các chất, không hấp, để nguội 45- 500C, điều chỉnh pH 8,6 rồi đổ đĩa.
- Nhận xét kết quả: Môi trường có màu xanh, đĩa thạch mịn, không có nước, độ dày vừa phải.

[tuyenlab]

3.4. Môi trường phân lập trực khuẩn bạch hầu:

3.4.1. Môi trường schroer.

Công thức:
- Thạch thường pH 7,5: 60 mL
- Dung dịch cơ bản: 200 mL
- Máu đã loại tơ huyết: 60 mL.
- Dung dịch kali telurit 5%: 30 mL.
- Dung dịch cơ bản gồm:
- Canh thang thường: 100 mL
- Pepton bột: 18 g.
- Natri acetat: 0,62 g.
- Glycerin: 4 mL.

Pha chế:
- Chuẩn bị đủ dụng cụ: ống đong, bình cầu, cân, pipet, đĩa petri, đèn cồn, ống nghiệm vô khuẩn.
- Chuẩn bị đủ các loại hoá chất
- Cân đong đủ các chất cho vào bình cầu.
- Cân, đong đủ các thành phần của dung dịch cơ bản hấp 110C trong 30 phút.
- Đun sôi thạch cho tan đều.
- Cho dung dịch cơ bản vào, để nguội 60C.
- Cho máu vào lắc thật đều, đổ ra đĩa petri hoặc ống nghiệm, để nghiêng ống cho đông.
- Để tủ ấm 37C/ 24 giờ.
- Để tủ lạnh dùng dần.

[tuyenlab]

3.5. Môi trường phân lập trực khuẩn lao:

3.5.1. Môi trường Loewenstein.

Công thức:
- Dung dịch cơ bản: 150 mL
- Bột khoai tây hấp: 6 g.
- Dung dịch xanh malachit 2%: 12 mL.
- Trứng gà tươi: 10 quả.

Dung dịch cơ bản gồm:
- Asparagin: 4 g
- Kali dihydrophosphat (K H2PO4): 1 g.
- Natri citrat: 1 g.
- Magnesi sulfat: 1 g.
- Glycerin: 10 mL.
- Nước cất : 100 mL.

Pha chế:
- Chuẩn bị đủ dụng cụ: ống đong, bình cầu, cân, pipet, đèn cồn, ống nghiệm, cốc thuỷ tinh, nồi nhôm và các loại hoá chất cần thiết để pha chế
- Cân, đong đủ các thành phần của dung dịch cơ bản vào nồi, đun nhỏ lửa và khuấy đều cho tới khi tan hết hoá chất.
- Điều chỉnh pH 7,2 bằng acid citric và amoniac. Lọc qua giấy lọc, phân phối vào bình cầu, hấp 110C 30 phút.
- Dùng bàn chải, xà phòng cọ sạch trứng, để ráo nước, ngâm trong cồn 90 trong 30 phút.
- Lấy ống có 6g bột khoai tây đã hấp 110C 30phút, đổ vào bình cầu có 150 mL dung dịch cơ bản, lắc đều rồi đun sôi cách thuỷ cho tới khi bột được hoà tan, dung dịch trở nên sền sệt thì lấy ra.
- Vớt trứng ra, đập từng quả vào cốc thuỷ tinh đã sấy, đánh tan đều rồi đổ vào bình cầu có dung dịch cơ bản và bột khoai tây.
- Thêm xanh malachit 2% đã hấp rồi lắc đều.
- Lọc qua vải gạc vô khuẩn rồi đóng ống nghiệm 18 mm, mỗi ống 6-7 mL.
- Để nằm nghiêng trong nồi hấp, hấp ở 85C trong 45 phút.
- Để tủ ấm 37C trong 24 giờ .
- Để tủ lạnh dùng dần.

[tuyenlab]

4. Môi trường xác định

Môi trường xác định là loại môi trường trong đó ngoài những chất dinh dưỡng cần thiết còn có một số chất dùng để nghiên cứu những đặc tính sinh vật hoá học nhằm xác định các loại vi khuẩn gây bệnh

4.1. Môi trường Kligler (KIA)

Công thức:
- Cao thịt 3 g
- Cao men 3g
- Pepton 20g
- NaCl tinh khiết 5g
- Lactose 10g
- Feric citrat 0.5g
- Glucose 1g
- Natri thiosulfat 0.5g
- Đỏ phenol, dung dịch 0.5% 6mL
- Thạch 12g
- Nước cất 1000mL

Pha chế

- Chuẩn bị đủ dụng cụ: ống đong, cân, pipet, đèn cồn, ống nghiệm, nồi nhôm.
- Chuẩn bị đủ các loại hoá chất cần thiết.
- Cân đong đủ các thành phần của môi trường.
- Cho thạch vào nước, đun sôi, khuấy liên tục tới khi tan hoàn toàn (hoặc hấp ở 1000C).
- Lần lượt cho thêm các hoá chất vào để hoà tan.
- Điều chỉnh pH=7,4 rồi thêm 6 mL dung dịch đỏ phenol 0,5% khuấy đều.
- Phân phối ra ống nghiệm 12 mm, mỗi ống 3 mL, hấp 1100C trong 30 phút hoặc hấp trước rồi phân phối ra các ống nghiệm.
- Lấy ra để ống môi trường nằm nghiêng sao cho mặt nghiêng dài khoảng 4-5 cm.
- Nhận xét kết quả: Môi trường có màu hồng đỏ, có chân.