05-29-2012, 10:14 AM
Vi khuẩn hiếu khí là những vi khuẩn tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc trong điều kiện có sự hiện diện của oxy phân tử. Tổng số vi khuẩn hiếu khí hiện diện trong mẫu phản ánh vệ sinh chế biến, độ tươi mới hay nguy cơ hư hỏng của thực phẩm. Chỉ tiêu này chỉ thị chất lượng vệ sinh của thực phẩm. Các nghiên cứu đã chỉ rõ tổng số vi khuẩn hiếu khí có tác dụng nhất để đánh giá chất lượng vệ sinh trong quá trình sản xuất, vận chuyển và bảo quản các loại thực phẩm không thuận lợi cho vi sinh vật phát triển như thực phẩm khô hay thực phẩm đông lạnh. Với các thực phẩm tươi sống, ngoài các giá trị như trên, tổng số vi khuẩn hiếu khí còn được dùng làm tiêu chuẩn hướng dẫn thời gian bảo quản.
Các thực phẩm đạt tiêu chuẩn vệ sinh về chỉ tiêu tổng số vi khuẩn hiếu khí vẫn có thể nhiễm các vi khuẩn gây bệnh khác. Do đó, chỉ tiêu tổng số vi khuẩn hiếu khí được sử dụng để đánh giá chất lượng vệ sinh hơn là độ an toàn của thực phẩm. Một nghiên cứu về sản xuất trứng đông lạnh thương phẩm đã cho thấy trứng bị nhiễm Salmonella, coliforms cho dù có chỉ tiêu vi khuẩn hiếu khí an toàn.
Chỉ số này được xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch dinh dưỡng và thể hiện dưới dạng số đơn vị hình thành khuẩn lạc ( colony forming unit, CFU) trong một đơn vị khối lượng hay thể tích thực phẩm. Chỉ số này có nhiều cách gọi khác nhau như: tổng số vi khuẩn hiếu khí (Aerobic Plate Count, APC), tổng số đếm trên đĩa (Total Plate Count, TPC), tổng số vi khuẩn sống (Total Viable Count, TVC), số đếm đĩa chuẩn (Standard Plate Count, SPC).
1. Nguyên lý
Sử dụng kỹ thuật nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường thạch, sau khi ủ hiếu khí ở nhiệt độ 300 C trong thời gian 72 giờ. Số lượng vi sinh vật trong 1g (ml) mẫu sản phẩm thực phẩm kiểm nghiệm được tính theo số khuẩn lạc đếm được từ các đĩa nuôi cấy theo các đậm độ pha loãng
2. Thiết bị, dụng cụ
- Thiết bị để khử trùng khô (tủ sấy) hoặc để khử trùng ướt (nồi hấp)
- Đĩa petri thuỷ tinh đường kính 90 -100 mm
- Pipet chia độ xả hết có dung tích 1ml và 10 ml, được chia vạch 0,1 và 0,5 ml tương ứng.
- Ống nghiệm 16mm x 160 mm , bình thuỷ tinh 250 – 500ml
- pH kế hoặc có độ chính xác *0,1 đơn vị ở 250C.
- Cân phân tích
- Nồi cách thuỷ điều chỉnh nhiệt độ 45 *10C.
- Tủ ấm điều chỉnh nhiệt độ 30 *10C.
- Thiết bị đếm khuẩn lạc
3. Hoá chất, môi trường
3.1. Môi trường thạch để đếm đĩa
- Thành phần:
Pepton từ casein: 5g
Cao nấm men: 2,5g
Glucose tinh khiết: 1,0g
Thạch: 9 -18g
Nước : 1000ml
- Pha chế:
+ Hoà tan các thành phần trong nước theo thứ tự: Cao nấm men, Pepton từ casein, Glucose và bột sữa gầy nếu cần. Đun nóng nước để hoà tan nhanh hơn
+ Cho thạch vào và đun đến sôi, thỉnh thoảng khuấy cho đến khi tan hết thạch.
+ Chỉnh pH sao cho sau khi hấp khử trùng là 7,0 * 0,2 ở 250C.
- Phân phối, khử trùng và bảo quản
+ Phân phối môi trường vào các ống nghiệm, mỗi ống từ 12ml đến 15ml hoặc vào bình hay chai.
+ Hấp khử trùng ở 1210C trong 15phút.
+ Nếu môi trường được sử dụng ngay thì để nguội 44- 470C trong nồi cách thuỷ. Nếu chưa sử dụng thì cần bảo quản ở khô ráo, tối với nhiệt độ 3 * 20C không quá 3 tháng.
3.2. Môi trường phủ (thạch màng)
- Thành phần:
Thạch 9g-18g
Nước 1000ml
- Pha chế:
+ Cho thạch vào nước và đun đến sôi, thường xuyên khuấy cho đến khi tan hết thạch.
+ Chỉnh pH sao cho sau khi hấp khử trùng là 7,0 * 0,2 ở 250C.
- Phân phối, khử trùng và bảo quản
+ Phân phối môi trường vào các ống nghiệm, mỗi ống 4ml hoặc vào bình hay chai thích hợp.
+ Hấp khử trùng ở 1210C trong 15phút.
+ Nếu môi trường được sử dụng ngay thì để nguội 44- 470C trong nồi cách thuỷ. Nếu chưa sử dụng thì cần bảo quản ở khô ráo,tối với nhiệt độ 3 * 20C không
quá 3 tháng.
4. Các bước tiến hành
4.1. Đồng nhất và pha loãng mẫu
- Mẫu thực phẩm được cắt nhỏ hoặc xay nhuyễn bằng máy trong điều kiện vô trùng cho tới khi được thể đồng nhất.
- Cân chính xác 10g thực phẩm đã được chuẩn bị (hoặc hút 10ml thực phẩm lỏng) cho vào bình nón có chứa 90 ml đệm pepton, lắc đều 2-3 phút thu được dung dịch mẫu thử 10-1.
- Hút chính xác 1ml dung dịch mẫu thử 10-1 cho sang ống nghiệm có chứa sẵn 9ml đệm pepton, đều 2-3 phút thu được dung dịch mẫu thử 10-2. Tiếp tục làm tương tự để có dung dịch pha loãng tiếp theo.
4.2. Đổ đĩa và ủ ấm
- Dùng pipet vô trùng hút mẫu thử và cho vào 2 đĩa petri vô khuẩn, mỗi đĩa 1ml nếu mẫu thử là chất lỏng hoặc 1ml huyền phù nếu mẫu thử ở các dạng khác. Lặp lại quá trình này ở các dịch pha loãng tiếp theo.
- Đổ vào mỗi đĩa 12-15ml môi trường thạch để đếm đĩa ở 44-470C.
- Trộn đều dịch nuôi cấy với môi trường thạch bằng cách xoay nhẹ đĩa petri theo hai chiều trái, phải. để đĩa trên mặt phẳng cho thạch đông đặc lại. Nếu dự đoán trong sản phẩm có chứa vi sinh vật mọc lan trên mặt thạch thì sau khi môi trường đã đông đổ tiếp 4ml thạch màng lên trên bề mặt.
- Để thạch đông, lật ngược đĩa và ủ ấm ở 300C *1 trong thời gian 72giờ *3.
- Thời gian bắt đầu pha loãng đến khi rót môi trường vào đĩa không được quá 30 phút.
4.3. Đếm khuẩn lạc
- Sau 48 giờ tính kết quả sơ bộ bằng cách đếm những khuẩn lạc đã mọc trên các đĩa nuôi cấy, sau 72 giờ tính kết quả chính thức, đếm toàn bộ số khuẩn lạc đã mọc và ghi nhận kết quả chính thức.
- Sự phân bố các khuẩn lạc trên các đĩa petri phải hợp lý. Độ pha loãng càng cao thì số khuẩn lạc càng ít. Nếu kết quả không hợp lý phải tiến hành lại các bước nuôi cấy
- Sử dụng máy đếm khuẩn lạc hoặc đếm bằng mắt thường.
- Các khuẩn lạc lan rộng được coi là khuẩn lạc đơn lẻ. Nếu ít hơn 1/4 đĩa mọc dày lan rộng thì đếm các khuẩn lạc trên phần đĩa còn lại và tính số tương ứng cho cả đĩa. Nếu quá 1/4 đĩa bị mọc dày lan rộng thì loại bỏ đĩa và không đếm.
![[Image: e02a8fd1c8c2693540fb32b083ed3ca1_45389995.hieukhi1.png]](http://nm5.upanh.com/b4.s26.d1/e02a8fd1c8c2693540fb32b083ed3ca1_45389995.hieukhi1.png)
![[Image: 1c91d36e5344a2df8289037b6790ad41_45390066.hieukhi2.png]](http://nm6.upanh.com/b2.s27.d2/1c91d36e5344a2df8289037b6790ad41_45390066.hieukhi2.png)
5. Tính toán và đánh giá kết quả
5.1. Trường hợp chung
Để kết quả có giá trị, cần thực hiện đếm khuẩn lạc trên ít nhất một đĩa có ít nhất 10 khuẩn lạc, nhiều nhất 300 khuẩn lạc. Tính số lượng N vi sinh vật có mặt trong mẫu thử theo trung bình từ hai độ pha loãng liên tiếp, sử dụng công thức:
![[Image: 63318b07dad8e885b96d9058c2f75c10_45390174.hieukhi3.png]](http://nm4.upanh.com/b6.s29.d1/63318b07dad8e885b96d9058c2f75c10_45390174.hieukhi3.png)
Trong đó:
C: Số khuẩn lạc trên các đĩa đã chọn
n1, n2: Số đĩa ở 2 đậm độ pha loãng liên tiếp đã chọn thứ 1, thứ 2
d: hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ nhất được giữ lại
(d=1 khi sản phẩm dạng lỏng (mẫu thử) không pha loãng được giữ lại.)
Làm tròn kết quả thu được đến hai chữ số có nghĩa. Lấy kết quả là số thích hợp giữa 1,0 và 9,9 nhân với 10x, trong đó x là lũy thừa tương ứng của 10 hoặc làm tròn hai số với hai chữ số có nghĩa.
5.2. Trường hợp các số đếm thấp
Trường hợp có một đĩa (mẫu thử hoặc huyền phù ban đầu hoặc dung dịch pha loãng thứ nhất) có chứa ít hơn 10 khuẩn lạc
- Nếu đĩa chứa ít hơn 10 khuẩn lạc, nhưng có ít nhất 4 khuẩn lạc, thì tính kết quả theo trường hợp chung và báo cáo kết quả là số ước tính x vi sinh vật trong một ml (sản phẩm lỏng) hoặc trong một gam (sản phẩm ở dạng khác)
- Nếu tổng số là từ 3 đến 1, thì kết quả được ghi như sau: "Có mặt các vi sinh vật nhưng nhỏ hơn (4xd) trên gam hoặc ml"
Trường hợp đĩa (mẫu thử hoặc huyền phù ban đầu hoặc dung dịch pha loãng thứ nhất) không chứa khuẩn lạc nào.
- Nếu đĩa của mẫu thử hoặc huyền phù ban đầu hoặc từ độ pha loãng thứ nhất đã cấy hoặc giữ lại không chứa khuẩn lạc nào, thì biểu thị kết quả như sau: “ít hơn 1/d vi sinh vật trong milit (sản phẩm dạng lỏng) hoặc ít hơn 1/d vi sinh vật trong gam (sản phẩm dạng khác)’’
Các thực phẩm đạt tiêu chuẩn vệ sinh về chỉ tiêu tổng số vi khuẩn hiếu khí vẫn có thể nhiễm các vi khuẩn gây bệnh khác. Do đó, chỉ tiêu tổng số vi khuẩn hiếu khí được sử dụng để đánh giá chất lượng vệ sinh hơn là độ an toàn của thực phẩm. Một nghiên cứu về sản xuất trứng đông lạnh thương phẩm đã cho thấy trứng bị nhiễm Salmonella, coliforms cho dù có chỉ tiêu vi khuẩn hiếu khí an toàn.
Chỉ số này được xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch dinh dưỡng và thể hiện dưới dạng số đơn vị hình thành khuẩn lạc ( colony forming unit, CFU) trong một đơn vị khối lượng hay thể tích thực phẩm. Chỉ số này có nhiều cách gọi khác nhau như: tổng số vi khuẩn hiếu khí (Aerobic Plate Count, APC), tổng số đếm trên đĩa (Total Plate Count, TPC), tổng số vi khuẩn sống (Total Viable Count, TVC), số đếm đĩa chuẩn (Standard Plate Count, SPC).
1. Nguyên lý
Sử dụng kỹ thuật nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường thạch, sau khi ủ hiếu khí ở nhiệt độ 300 C trong thời gian 72 giờ. Số lượng vi sinh vật trong 1g (ml) mẫu sản phẩm thực phẩm kiểm nghiệm được tính theo số khuẩn lạc đếm được từ các đĩa nuôi cấy theo các đậm độ pha loãng
2. Thiết bị, dụng cụ
- Thiết bị để khử trùng khô (tủ sấy) hoặc để khử trùng ướt (nồi hấp)
- Đĩa petri thuỷ tinh đường kính 90 -100 mm
- Pipet chia độ xả hết có dung tích 1ml và 10 ml, được chia vạch 0,1 và 0,5 ml tương ứng.
- Ống nghiệm 16mm x 160 mm , bình thuỷ tinh 250 – 500ml
- pH kế hoặc có độ chính xác *0,1 đơn vị ở 250C.
- Cân phân tích
- Nồi cách thuỷ điều chỉnh nhiệt độ 45 *10C.
- Tủ ấm điều chỉnh nhiệt độ 30 *10C.
- Thiết bị đếm khuẩn lạc
3. Hoá chất, môi trường
3.1. Môi trường thạch để đếm đĩa
- Thành phần:
Pepton từ casein: 5g
Cao nấm men: 2,5g
Glucose tinh khiết: 1,0g
Thạch: 9 -18g
Nước : 1000ml
- Pha chế:
+ Hoà tan các thành phần trong nước theo thứ tự: Cao nấm men, Pepton từ casein, Glucose và bột sữa gầy nếu cần. Đun nóng nước để hoà tan nhanh hơn
+ Cho thạch vào và đun đến sôi, thỉnh thoảng khuấy cho đến khi tan hết thạch.
+ Chỉnh pH sao cho sau khi hấp khử trùng là 7,0 * 0,2 ở 250C.
- Phân phối, khử trùng và bảo quản
+ Phân phối môi trường vào các ống nghiệm, mỗi ống từ 12ml đến 15ml hoặc vào bình hay chai.
+ Hấp khử trùng ở 1210C trong 15phút.
+ Nếu môi trường được sử dụng ngay thì để nguội 44- 470C trong nồi cách thuỷ. Nếu chưa sử dụng thì cần bảo quản ở khô ráo, tối với nhiệt độ 3 * 20C không quá 3 tháng.
3.2. Môi trường phủ (thạch màng)
- Thành phần:
Thạch 9g-18g
Nước 1000ml
- Pha chế:
+ Cho thạch vào nước và đun đến sôi, thường xuyên khuấy cho đến khi tan hết thạch.
+ Chỉnh pH sao cho sau khi hấp khử trùng là 7,0 * 0,2 ở 250C.
- Phân phối, khử trùng và bảo quản
+ Phân phối môi trường vào các ống nghiệm, mỗi ống 4ml hoặc vào bình hay chai thích hợp.
+ Hấp khử trùng ở 1210C trong 15phút.
+ Nếu môi trường được sử dụng ngay thì để nguội 44- 470C trong nồi cách thuỷ. Nếu chưa sử dụng thì cần bảo quản ở khô ráo,tối với nhiệt độ 3 * 20C không
quá 3 tháng.
4. Các bước tiến hành
4.1. Đồng nhất và pha loãng mẫu
- Mẫu thực phẩm được cắt nhỏ hoặc xay nhuyễn bằng máy trong điều kiện vô trùng cho tới khi được thể đồng nhất.
- Cân chính xác 10g thực phẩm đã được chuẩn bị (hoặc hút 10ml thực phẩm lỏng) cho vào bình nón có chứa 90 ml đệm pepton, lắc đều 2-3 phút thu được dung dịch mẫu thử 10-1.
- Hút chính xác 1ml dung dịch mẫu thử 10-1 cho sang ống nghiệm có chứa sẵn 9ml đệm pepton, đều 2-3 phút thu được dung dịch mẫu thử 10-2. Tiếp tục làm tương tự để có dung dịch pha loãng tiếp theo.
4.2. Đổ đĩa và ủ ấm
- Dùng pipet vô trùng hút mẫu thử và cho vào 2 đĩa petri vô khuẩn, mỗi đĩa 1ml nếu mẫu thử là chất lỏng hoặc 1ml huyền phù nếu mẫu thử ở các dạng khác. Lặp lại quá trình này ở các dịch pha loãng tiếp theo.
- Đổ vào mỗi đĩa 12-15ml môi trường thạch để đếm đĩa ở 44-470C.
- Trộn đều dịch nuôi cấy với môi trường thạch bằng cách xoay nhẹ đĩa petri theo hai chiều trái, phải. để đĩa trên mặt phẳng cho thạch đông đặc lại. Nếu dự đoán trong sản phẩm có chứa vi sinh vật mọc lan trên mặt thạch thì sau khi môi trường đã đông đổ tiếp 4ml thạch màng lên trên bề mặt.
- Để thạch đông, lật ngược đĩa và ủ ấm ở 300C *1 trong thời gian 72giờ *3.
- Thời gian bắt đầu pha loãng đến khi rót môi trường vào đĩa không được quá 30 phút.
4.3. Đếm khuẩn lạc
- Sau 48 giờ tính kết quả sơ bộ bằng cách đếm những khuẩn lạc đã mọc trên các đĩa nuôi cấy, sau 72 giờ tính kết quả chính thức, đếm toàn bộ số khuẩn lạc đã mọc và ghi nhận kết quả chính thức.
- Sự phân bố các khuẩn lạc trên các đĩa petri phải hợp lý. Độ pha loãng càng cao thì số khuẩn lạc càng ít. Nếu kết quả không hợp lý phải tiến hành lại các bước nuôi cấy
- Sử dụng máy đếm khuẩn lạc hoặc đếm bằng mắt thường.
- Các khuẩn lạc lan rộng được coi là khuẩn lạc đơn lẻ. Nếu ít hơn 1/4 đĩa mọc dày lan rộng thì đếm các khuẩn lạc trên phần đĩa còn lại và tính số tương ứng cho cả đĩa. Nếu quá 1/4 đĩa bị mọc dày lan rộng thì loại bỏ đĩa và không đếm.
5. Tính toán và đánh giá kết quả
5.1. Trường hợp chung
Để kết quả có giá trị, cần thực hiện đếm khuẩn lạc trên ít nhất một đĩa có ít nhất 10 khuẩn lạc, nhiều nhất 300 khuẩn lạc. Tính số lượng N vi sinh vật có mặt trong mẫu thử theo trung bình từ hai độ pha loãng liên tiếp, sử dụng công thức:
Trong đó:
C: Số khuẩn lạc trên các đĩa đã chọn
n1, n2: Số đĩa ở 2 đậm độ pha loãng liên tiếp đã chọn thứ 1, thứ 2
d: hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ nhất được giữ lại
(d=1 khi sản phẩm dạng lỏng (mẫu thử) không pha loãng được giữ lại.)
Làm tròn kết quả thu được đến hai chữ số có nghĩa. Lấy kết quả là số thích hợp giữa 1,0 và 9,9 nhân với 10x, trong đó x là lũy thừa tương ứng của 10 hoặc làm tròn hai số với hai chữ số có nghĩa.
5.2. Trường hợp các số đếm thấp
Trường hợp có một đĩa (mẫu thử hoặc huyền phù ban đầu hoặc dung dịch pha loãng thứ nhất) có chứa ít hơn 10 khuẩn lạc
- Nếu đĩa chứa ít hơn 10 khuẩn lạc, nhưng có ít nhất 4 khuẩn lạc, thì tính kết quả theo trường hợp chung và báo cáo kết quả là số ước tính x vi sinh vật trong một ml (sản phẩm lỏng) hoặc trong một gam (sản phẩm ở dạng khác)
- Nếu tổng số là từ 3 đến 1, thì kết quả được ghi như sau: "Có mặt các vi sinh vật nhưng nhỏ hơn (4xd) trên gam hoặc ml"
Trường hợp đĩa (mẫu thử hoặc huyền phù ban đầu hoặc dung dịch pha loãng thứ nhất) không chứa khuẩn lạc nào.
- Nếu đĩa của mẫu thử hoặc huyền phù ban đầu hoặc từ độ pha loãng thứ nhất đã cấy hoặc giữ lại không chứa khuẩn lạc nào, thì biểu thị kết quả như sau: “ít hơn 1/d vi sinh vật trong milit (sản phẩm dạng lỏng) hoặc ít hơn 1/d vi sinh vật trong gam (sản phẩm dạng khác)’’
