1. Nguyên tắc
Số khuẩn lạc điển hình bờ hình răng cưa, màu đỏ hồng, xung quanh có vùng đục (lên men đường mannit và phân giải lecithin trong lòng đỏ trứng gà trên môi trường thạch MYP) và có các phản ứng sinh hóa phù hợp được tính là số lượng B. cereus trong một g hoặc 1 ml mẫu thực phẩm.
2. Dụng cụ, thiết bị
- Máy đồng nhất mẫu
- Tủ sấy
- Nồi hấp áp lực
- Tủ ấm 300C
- Đĩa petri vô trùng đường kính 90 – 100 mm
- Pipet vô trùng các loại xả hết có dung tích định danh 1 , 5, 10 ml.
- Nồi cách thủy
- Máy đếm khuẩn lạc
- Bình thủy tinh vô trùng, dung tích 250 ml, 500 ml
- Ống nghiệm vô trùng, 16 x 18 mm
- pH mét
- Máy vortex
3. Môi trường, hoá chất
- Nước pepton đệm Buffered Pepton Water (BPW).
- Thạch Mannitol-Egg Yolk-Polymycin (MYP).
- Nhũ tương lòng đỏ trứng (Egg Yolk Emulsion), 50%
- Thạch dinh dưỡng Nutrient Agar cho B.cereus.
- Thạch máu cừu (Trypticase Soy Sheep) hoặc máu thỏ.
- Dung dịch polymicin B sunfat 0,1 %.
- Hoá chất nhuộm Gram.
4. Quy trình phân tích
4.1. Đồng nhất và pha loãng mẫu
- Mẫu thực phẩm được cắt nhỏ hoặc xay nhuyễn bằng máy trong điều kiện vô trùng cho tới khi được thể đồng nhất.
- Cho 25g mẫu vào túi PE, bổ sung 225ml môi trường pepton đệm (BPW) đồng nhất để có độ pha loãng 10-1, đồng nhất bằng Stomacher trong 1 phút.
- Hút chính xác 1ml dung dịch mẫu thử 10-1 cho sang ống nghiệm có chứa sẵn 9 ml nước pepon đệm, lắc đều 2-3 phút thu được dung dịch mẫu thử 10-2. Tiếp tục làm tương tự để có dung dịch mẫu thử 10-3.
4. 2. Nuôi cấy phân lập
- Đánh dấu lên đĩa thạch tên mẫu, nồng độ dung dịch mẫu thử.
- Dùng pipet 1 ml vô trùng, hút chính xác 0,1 ml từ dung dịch mẫu thử 10-1 (hoặc 0,1 ml từ mẫu thực phẩm lỏng) nhỏ lên bề mặt 2 đĩa thạch MYP, mỗi đĩa 0,1 ml. Làm tương tự với các độ pha loãng tiếp theo.
- Dùng dụng cụ dàn mẫu thủy tinh dàn đều dịch cấy lên khắp mặt đĩa thạch sao cho các khuẩn lạc mọc phân tán đều. Để các đĩa có đậy nắp ở nhiệt độ phòng khoảng 15 phút rồi lật ngược đưa vào tủ.
- Ủ ở 300C / 24h. Nếu không thấy các khuẩn lạc ủ thêm 24h nữa.
Lưu ý: Đĩa thạch nuôi cấy phải được hong khô trước khi dùng. Mỗi mẫu thực phẩm phải được nuôi cấy ít nhất 3 đậm độ pha loãng. Mỗi đậm độ phải được cấy lên 2 đĩa thạch để tính trung bình cộng của mỗi đậm độ.
4.3. Đểm các khuẩn lạc điển hình B.cereus
- Khuẩn lạc B.cereus điển hình trên môi trường thạch MYP: dẹt, đường kính 2 – 3 mm, bờ hình răng cưa, màu đỏ hồng, xung quanh có vùng đục.
- Chọn các đĩa ở hai đậm độ pha loãng liên tiếp, đếm các khuẩn lạc điển hình ở các đĩa này.
4.4. Tăng sinh thuần chủng
- Chọn ít nhất 5 khuẩn lạc điển hình từ đĩa thạch MYP cấy sang môi trường thạch nghiêng dinh dưỡng.
Ủ ấm 300C/ 24h.
4.5. Xác định
- Nhuộm Gram : cấy ria các khuẩn lạc từ ống thạch dinh dưỡng
Nhuộm gram, quan sát dưới kính hiển vi.
- Sau khi thực hiện xong quy trình nhuộm, quan sát màu nhuộm của tế bào bằng vật kính 100x. B.cereus là trực khuẩn lớn, Gram dương, thường kết hợp với nhau tạo thành dạng chuỗi. Bào tử hình bầu dục, không có dạng nang bào tử.
- Thử nghiệm khả năng tan máu: cấy các khuẩn lên môi trường thạch máu. Ủ ở 300C trong 24 giờ. B. cereus làm tan máu mạnh và tạo vùng tan máu hoàn toàn (β), đường kính 2-4 mm xung quanh vùng phát triển.
5. Đọc kết quả
Khuẩn lạc của B. cereus môi trường thạch MYP: dẹt, đường kính 2 – 3 mm, bờ hình răng cưa, màu đỏ hồng, xung quanh có vùng đục; tan máu β.
![[Image: thach+MYP.jpg]](https://lh3.googleusercontent.com/-HFgie_mhWII/UMhHHJCzlJI/AAAAAAAAARc/VEBjJSF7Wqk/s326/thach+MYP.jpg)
Hình 1: B. cereus trên thạch MYP
![[Image: tan+mau+Beta.jpg]](https://lh6.googleusercontent.com/-srvly83RqHQ/UMhHgrkVHvI/AAAAAAAAARk/yjqVu5yE3hc/s365/tan+mau+Beta.jpg)
Hình 2: Tan máu β của B. cereus
6. Tính kết quả
- Tính số lượng a của B. cereus đã được khẳng định trên mỗi đĩa, theo công thức:
A: là số lượng khuẩn lạc nghi ngờ mang đi thử TCSVHH
b: số lượng khuẩn lạc dương tính đã khẳng định bằng tcsvhh
c: là tổng số khuẩn lạc nghi ngờ đếm được trên đĩa
- Tính số lượng N B. cereus đã được khẳng định có mặt trong mẫu thử.
Tính số lượng N B. cereus đã được khẳng định có mặt trong mẫu thử, là trung bình của hai đậm độ pha loãng liên tiếp bằng công thức sau:
Trong đó:
∑a là tổng số khuẩn lạc B. cereus đã được nhận dạng ở các đĩa của 2 đậm độ pha loãng liên tiếp được giữ lại.
V là thể tích của chất cấy trên mỗi đĩa, tính bằng ml
n1 là số đĩa đã được chọn ở độ pha loãng thứ nhất
n2 là số đĩa đã được chọn ở độ pha loãng thứ hai
d là độ pha loãng tương ứng với dung dịch pha loãng thứ nhất được giữ lại.
- Làm tròn kết quả đã tính đến hai chữ số có nghĩa
- Báo cáo kết quả theo số B. cereus có trong một ml hoặc một gam sản phẩm, được biểu thị theo số từ 1,0 đến 9,9 nhân 10x, trong đó x là luỹ thừa tương ứng của 10.
Số khuẩn lạc điển hình bờ hình răng cưa, màu đỏ hồng, xung quanh có vùng đục (lên men đường mannit và phân giải lecithin trong lòng đỏ trứng gà trên môi trường thạch MYP) và có các phản ứng sinh hóa phù hợp được tính là số lượng B. cereus trong một g hoặc 1 ml mẫu thực phẩm.
2. Dụng cụ, thiết bị
- Máy đồng nhất mẫu
- Tủ sấy
- Nồi hấp áp lực
- Tủ ấm 300C
- Đĩa petri vô trùng đường kính 90 – 100 mm
- Pipet vô trùng các loại xả hết có dung tích định danh 1 , 5, 10 ml.
- Nồi cách thủy
- Máy đếm khuẩn lạc
- Bình thủy tinh vô trùng, dung tích 250 ml, 500 ml
- Ống nghiệm vô trùng, 16 x 18 mm
- pH mét
- Máy vortex
3. Môi trường, hoá chất
- Nước pepton đệm Buffered Pepton Water (BPW).
- Thạch Mannitol-Egg Yolk-Polymycin (MYP).
- Nhũ tương lòng đỏ trứng (Egg Yolk Emulsion), 50%
- Thạch dinh dưỡng Nutrient Agar cho B.cereus.
- Thạch máu cừu (Trypticase Soy Sheep) hoặc máu thỏ.
- Dung dịch polymicin B sunfat 0,1 %.
- Hoá chất nhuộm Gram.
4. Quy trình phân tích
4.1. Đồng nhất và pha loãng mẫu
- Mẫu thực phẩm được cắt nhỏ hoặc xay nhuyễn bằng máy trong điều kiện vô trùng cho tới khi được thể đồng nhất.
- Cho 25g mẫu vào túi PE, bổ sung 225ml môi trường pepton đệm (BPW) đồng nhất để có độ pha loãng 10-1, đồng nhất bằng Stomacher trong 1 phút.
- Hút chính xác 1ml dung dịch mẫu thử 10-1 cho sang ống nghiệm có chứa sẵn 9 ml nước pepon đệm, lắc đều 2-3 phút thu được dung dịch mẫu thử 10-2. Tiếp tục làm tương tự để có dung dịch mẫu thử 10-3.
4. 2. Nuôi cấy phân lập
- Đánh dấu lên đĩa thạch tên mẫu, nồng độ dung dịch mẫu thử.
- Dùng pipet 1 ml vô trùng, hút chính xác 0,1 ml từ dung dịch mẫu thử 10-1 (hoặc 0,1 ml từ mẫu thực phẩm lỏng) nhỏ lên bề mặt 2 đĩa thạch MYP, mỗi đĩa 0,1 ml. Làm tương tự với các độ pha loãng tiếp theo.
- Dùng dụng cụ dàn mẫu thủy tinh dàn đều dịch cấy lên khắp mặt đĩa thạch sao cho các khuẩn lạc mọc phân tán đều. Để các đĩa có đậy nắp ở nhiệt độ phòng khoảng 15 phút rồi lật ngược đưa vào tủ.
- Ủ ở 300C / 24h. Nếu không thấy các khuẩn lạc ủ thêm 24h nữa.
Lưu ý: Đĩa thạch nuôi cấy phải được hong khô trước khi dùng. Mỗi mẫu thực phẩm phải được nuôi cấy ít nhất 3 đậm độ pha loãng. Mỗi đậm độ phải được cấy lên 2 đĩa thạch để tính trung bình cộng của mỗi đậm độ.
4.3. Đểm các khuẩn lạc điển hình B.cereus
- Khuẩn lạc B.cereus điển hình trên môi trường thạch MYP: dẹt, đường kính 2 – 3 mm, bờ hình răng cưa, màu đỏ hồng, xung quanh có vùng đục.
- Chọn các đĩa ở hai đậm độ pha loãng liên tiếp, đếm các khuẩn lạc điển hình ở các đĩa này.
4.4. Tăng sinh thuần chủng
- Chọn ít nhất 5 khuẩn lạc điển hình từ đĩa thạch MYP cấy sang môi trường thạch nghiêng dinh dưỡng.
Ủ ấm 300C/ 24h.
4.5. Xác định
- Nhuộm Gram : cấy ria các khuẩn lạc từ ống thạch dinh dưỡng
Nhuộm gram, quan sát dưới kính hiển vi.
- Sau khi thực hiện xong quy trình nhuộm, quan sát màu nhuộm của tế bào bằng vật kính 100x. B.cereus là trực khuẩn lớn, Gram dương, thường kết hợp với nhau tạo thành dạng chuỗi. Bào tử hình bầu dục, không có dạng nang bào tử.
- Thử nghiệm khả năng tan máu: cấy các khuẩn lên môi trường thạch máu. Ủ ở 300C trong 24 giờ. B. cereus làm tan máu mạnh và tạo vùng tan máu hoàn toàn (β), đường kính 2-4 mm xung quanh vùng phát triển.
5. Đọc kết quả
Khuẩn lạc của B. cereus môi trường thạch MYP: dẹt, đường kính 2 – 3 mm, bờ hình răng cưa, màu đỏ hồng, xung quanh có vùng đục; tan máu β.
Hình 1: B. cereus trên thạch MYP
Hình 2: Tan máu β của B. cereus
6. Tính kết quả
- Tính số lượng a của B. cereus đã được khẳng định trên mỗi đĩa, theo công thức:
b
a =------------------- x c
A
Trong đó:a =------------------- x c
A
A: là số lượng khuẩn lạc nghi ngờ mang đi thử TCSVHH
b: số lượng khuẩn lạc dương tính đã khẳng định bằng tcsvhh
c: là tổng số khuẩn lạc nghi ngờ đếm được trên đĩa
- Tính số lượng N B. cereus đã được khẳng định có mặt trong mẫu thử.
Tính số lượng N B. cereus đã được khẳng định có mặt trong mẫu thử, là trung bình của hai đậm độ pha loãng liên tiếp bằng công thức sau:
∑a
N =----------------------
V (n1+ 0,1 n2) d
N =----------------------
V (n1+ 0,1 n2) d
Trong đó:
∑a là tổng số khuẩn lạc B. cereus đã được nhận dạng ở các đĩa của 2 đậm độ pha loãng liên tiếp được giữ lại.
V là thể tích của chất cấy trên mỗi đĩa, tính bằng ml
n1 là số đĩa đã được chọn ở độ pha loãng thứ nhất
n2 là số đĩa đã được chọn ở độ pha loãng thứ hai
d là độ pha loãng tương ứng với dung dịch pha loãng thứ nhất được giữ lại.
- Làm tròn kết quả đã tính đến hai chữ số có nghĩa
- Báo cáo kết quả theo số B. cereus có trong một ml hoặc một gam sản phẩm, được biểu thị theo số từ 1,0 đến 9,9 nhân 10x, trong đó x là luỹ thừa tương ứng của 10.
