[TH] Kỹ thuật sắc ký lớp mỏng

[tuyenlab]

NỘI DUNG

1. Nguyên lý và ứng dụng của phương pháp sắc ký và sắc ký lớp mỏng.

- Năm 1906, nhà bác học Nga Tsvet đã cho dung dịch các sắc tố thực vật (Clorophyl và xanthophyl) trong ête dầu hoả lên cột nhồi bột mịn calci carbonat, ông thấy các sắc tố bị hấp phụ trên đầu cột. Khi cho dung môi nguyên chất (ête dầu hoả) lên cột, các sắc tố di chuyển trong cột từ trên xuống dưới, mỗi sắc tố có một tốc độ riêng, tách thành những vùng hay vòng màu xếp chồng lên nhau, hình thành một hệ mà Tsvet gọi sắc đồ. Ông đặt tên cho phương pháp tách này là sắc ký (chromato-graphy). Trong tiếng Hy lạp chroma là màu graphein là viết. Tên gọi này ngày nay vẫn được sử dụng mặc dù phương pháp được dùng tách các chất không màu.

- Sắc ký là một nhóm các phương pháp hoá lý dùng để tách các thành phần của một hỗn hợp. Sự tách sắc ký được dựa trên sự phân chia khác nhau của các chất khác nhau vào hai pha luôn tiếp xúc và không hoà lẫn vào nhau: một pha tĩnh và một pha động (trong thí nghiệm của Tsvet, pha tĩnh là calci carbonat và pha động là dung môi ête dầu hoả).

Quá trình tách sắc ký thường bao gồm 3 giai đoạn chính:

a. Đưa hỗn hợp lên pha tĩnh (ví dụ đưa các sắc tố lên đầu cột canlci carbonat).

Các chất được giữ trên pha tĩnh.

b. Cho pha động chạy qua pha tĩnh (ví dụ: dung môi ête dầu hoả qua cột),

kéo theo các chất di chuyển trên pha tĩnh với tốc độ khác nhau, tách khỏi nhau và có vị trí khác nhau trên pha tĩnh tạo thành sắc đồ. Giai đoạn này gọi là khai triển sắc ký.

c. Phát hiện các chất: các chất màu có thể phát hiện dễ dàng, các chất không màu có thể phát hiện bằng đèn tử ngoại hay bằng các thuốc thử. Trong sắc ký rửa giải có thể phát hiện các chất khi chúng đi ra khỏi cột bằng cách cho dung dịch rửa giải đi qua một bộ phận phát hiện gọi là detectơ (detector) đặt sau cột.

- Quá trình sắc ký lớp mỏng được tiến hành trên một lớp bột rải và được giữ trên một mặt tấm kính, chất dẻo hay kim loại. Bản thân lớp mỏng có thể là pha tĩnh hoặc chỉ là chất mang (hay giá đỡ) để giữ pha tĩnh trên đó. Pha động là chất lỏng sẽ thấm và chạy trên lớp mỏng do tác động của lực mao dẫn và đôi khi cả trọng lực, điện thế.

- SKLM được dùng để phát hiện các chất trong hỗn hợp, thử độ tinh khiết của sản phẩm, được dùng nhiều trong các phòng thí nghiệm lâm sàng, trong nghiên cứu hoá, sinh.

Ưu điểm của phương pháp:

- Nhanh (15 phút – 3 giờ)

- Để kết hợp định tính với định lượng, bán định lượng

- Tách tốt nhiều hỗn hợp phức tạp

2 Chuẩn bị


2.1 Chất hấp phụ, bản mỏng sắc ký.

Trong SKLM, bột rải lớp mỏng thường là loại bột rất mịn chất hấp phụ. các chất hấp phụ thường dùng là:

- Silicagel loại hạt qua rây cỡ lỗ 0,07-0,10 mm.

- Nhôm oxyd (alumina)

- Loại bột có thêm bột bó (thạch cao ngậm 1,5 H[sub]2[/sub]O) là chất kết dính, có ký hiệu chữ G, loại có chỉ thị huỳnh quang có chữ F (ví dụ silicagel GF254).

SKLM thường được tiến hành trên một bản thuỷ tinh hay chất dẻo có rải một lớp mỏng các hạt bột mịn dính chắc trên đó. Lớp mỏng này thường được dùng làm pha tĩnh. Các pha tĩnh và động trong SKLM cũng tương tự các pha dùng trong các sắc ký lỏng hiệu năng cao (sắc ký hấp phụ, sắc ký phân bố pha thuận và pha ngược, sắc ký trao đổi ion, sắc ký trên gel). Bản mỏng có thể tự rải lấy, nhưng ngày nay thường dùng loại bản mỏng tráng sẵn.

Bản mỏng thường phải sấy 120[sup]o[/sup]C trong 30 phút đê hoạt hoá trước khi dùng.

2.2. Dung môi

Dung môi phải là loại tinh khiết, thường dùng hỗn hợp 2-3 các dung môi. Các dung môi xếp theo thứ tự mạnh dần (sức đẩy, phản hấp phụ): hexan, heptan, cyclohexan, carbon tetraclorid, benzen, cloroform, butyl acetat, ethet, ethyl acetat, pyridin, aceton, ethanol, methanol, nước.

2.3. Bình sắc ký

Có thể là bình chuyên dụng hoặc các lọ rộng miệng, ống hình trụ, có nắp

Hình 1. Bình sắc ký

1. Bản mỏng 2.Hơi dung môi 3. Giấy lọc 4. Dung môi 5. Miếng kính dày

3. Tiến hành

3.1. Chuẩn bị

- Chuẩn bị bản mỏng và bình săc ký thích hợp

- Chuẩn bị dung môi: cho dung môi vào bình, quanh thành bình lót giấy lọc để bão hoà dung môi được nhanh hơn. Nếu tiến hành sắc ký phân bố thì chuẩnbị dung môi và bình như với sắc ký giấy (Hỗn hợp dung môi tự tách làm hai lớp, lớp pha động cho vào đáy bình, lớp pha tĩnh cho vào 1 cốc đặt vào bình).

3.2. Chấm dung dịch lên bản mỏng

Kẻ một vạch thẳng nằm ngang bằng bút chì, cách mép dưới của bản mỏng 1 cm làm vạch xuất phát. Dùng mao quản hay micropipet chấm các vết dung dịch thử và dung dịch chuẩn lên đó. Các vết phải cách nhau và cách mép bản mỏng ít nhất 1 cm.

3.3. Khai triển sắc ký:

Là quá trình cho pha động chạy, kéo mẫu phân tích di chuyển trên pha tĩnh. Đặt bản mỏng vào bình sắc ký đã bão hoà hơi dung môi của pha động, mép phía chấm mẫu được nhúng vào dung môi động nhưng không được cho điểm đã chấm mẫu chạm trực tiếp vào dung môi động. Sau khi dung môi chạy được nửa hay hai phần ba bản mỏng ta lấy ra để khô hay sấy khô.

Hình 2. Các kiểu triển khai sắc ký (a) Sắc ký lên (b) Sắc ký ngang

3.4. Phát hiện các vết trên bản mỏng:

Có nhiều phương pháp để phát hiện các vết .Hai cách phổ biến có thể dùng để phát hiện hầu hết các chất hữu cơ là phun dung dịch iod hay acid sulfuric: sẽ xuất hiện các vết màu tối. Có thể phun các thuốc thử đặc hiệu (như ninhydrin cho acid amin). Cũng có thể thêm một chất huỳnh quang vào pha tĩnh: cả bản mỏng sẽ sáng (huỳnh quang) khi soi đèn tử ngoại (ví dụ đèn Hg cho 254 nm). Nơi có chất sẽ tối hoặc có huỳnh quang màu khác với nền sáng của bản mỏng.

4. Đọc kết quả

Vị trí của vết là cơ sở để định tính một chất. Trong SKLM, vị trí vết được biểu thụ bằng chỉ số R[sub]f[/sub]. (retention factor-hệ số lưu giữ). Có thể nói, nếu trên sắc đồ có một vết chất chưa biết nằm ngang (có cùng chỉ số R[sub]f[/sub]) với vết của chất chuẩn thì chất chưa biết đó chính là chất chuẩn.

R[sub]f[/sub] của chất X được tính như sau:

R[sub]f,X[/sub] = OX / OF = tỷ số quãng đường đi giữa X và dung môi.

Với cách định nghĩa này R[sub]f[/sub] thường nhỏ hơn 1. Để tránh viết các số thập phân, có thể cho trị giá Rf x 100 và chỉ viết 2 chữ số. Ví dụ viết 73 thay cho 0,73.

Tuy vậy R[sub]f [/sub]thay đổi theo điều kiện thực nghiệm nên không ổn định và định tính dựa vào R[sub]f[/sub] là không chắc chắn.

Việc định tính dựa vào R[sub]f[/sub] không thể dựa vào các giá trị cho trên sách vở, tài liệu. Nếu dựa trên thực nghiệm cũng nên làm trong những hệ SKLM khác nhau (bản mỏng, hệ dung môi khác nhau).

[lưu thị chiêm]

lâu ùi mí đọc đến sắc kí.ko bit chiều nay có giảng đc bài ko.hi2.thanks your post ad