03-23-2012, 10:05 AM
Các phương pháp sắc ký
Sắc ký là một trong những phương pháp quan trọng trong các phương pháp phân tích hóa sinh. Sắc ký được áp dụng rất rộng rãi với nhiều mục đích khác nhau nh là được sử dụng để định tính, định lượng, điều chế các chất tinh khiết, xác định các hằng số hóa lý, nghiên cứu các quá trình động học và xúc tác... Ngoài ra nó còn được áp dụng ở các ngành có liên quan tới hóa học như y dược, nông nghiệp, thực phẩm, bảo vệ môi trường, luyện kim, dầu mỏ địa chất...
1. Khái niệm chung.
Sắc ký là sự tách liên tục các chất từ hỗn hợp các chất do sự phân bố không đồng đều của chúng gĩa pha cố định (pha tĩnh) và pha di động khi cho pha di động đi xuyên qua pha cố định .
2.Các phương pháp sắc ký cơ bản:
Gồm 2 loại cơ bản:- Sắc ký khí
- Sắc ký lỏng
2.1. Sắc ký khí: Pha di dộng là một chất khí.
- Mẫu phân tích đợc hóa hơi ở nhiệt độ cao và nhờ có khí chứa trong bom khí dẫn vào cột phân tách nằm trong buồng điều nhiệt và quá trình phân tích các chất diễn ra ở đây.
- Cột sắc ký thờng có đờng kính rất nhỏ ( vài mm) và xoắn lò so trong buồng điều nhiệt. Tùy theo pha tĩnh ngời ta phân ra các loại sắc ký khí khác nhau.
2.1.1. Sắc ký khí-rắn:
Pha tĩnh là một chất rắn và cơ chế phân tách các chất dựa trên nguyên lý của sắc ký hấp phụ.
2.1.2.Sắc ký khí-lỏng:
Pha tĩnh là một chất lỏng và cơ chế phân tách các chất dựa trên nguyên lý của sắc ký phân bố.
Sắc ký khí thường dùng trong phân tích, phát hiện các chất và sử dụng cột sắc ký chuyên dụng. Phương pháp này có u điểm là thời gian ngắn, lượng mẫu ít, độ chính xác cao.
2.2. Sắc ký lỏng:
Pha động là chất lỏng. Có nhiều cách phân loại khác nhau.
2.2.1. Dựa trên đặc tính của pha tĩnh (cơ chế của quá trình phân tách), có các loại sắc ký sau:
*Sắc ký hấp phụ: Sự phân tách các chất là do ái lực khác nhau của chất phân tách đối với chất hấp phụ là chất rắn (pha cố định).
* Sắc ký trao đổi ion: Sự phân tách các ion là do các ion đợc phân tách trong dung dịch có ái lực khác nhau với các trung tâm trao đổi ion (nhóm chứa ion) trên chất rắn là pha cố định. Các chất đó gọi là các chất trao đổi ion mà thông thờng nhất là các nhựa trao đổi ion.
Sắc ký trao đổi ion gồm 2 quá trình riêng rẽ:
- Gắn chất phân tích mang điện ( hòa tan trong pha động ) và ion mang điện tích trái dấu ở pha cố định.
- Đẩy chất phân tích mang điện đợc giữ trên pha tĩnh bằng một dung dịch chứa chất mang điện tích khác ( Dung dịch đẩy) có ái lực liên kết ion với pha tĩnh lớn hơn chất phân tích.
phân bố: Pha tĩnh là một chất lỏng, còn gọi là sắc ký lỏng-lỏng.
• Các chất đợc phân tách dựa trên sự phân bố khác nhau của mỗi chất hòa tan vào 2 pha lỏng không trộn lẫn với nhau. Mỗi chất có hệ số phân bố riêng trong một hệ dung môi nhất định.
• K= Cs / Cm.
• Cs : nồng độ chất trong pha tĩnh.
• Cm: Nồng độ chất trong pha động.
• K: Đại lợng đặc trng cho từng chất phụ thuộc vào bản chất chất tan và nhiệt độ.
• K càng lớn, chất di chuyển càng chậm.
*Sắc ký lọc gel: Còn gọi là sắc ký sàng phân tử trên cơ sở chất liệu hạt gel xốp với kích thớc hạt gel cũng nh lỗ hạt gel có thể tạo ra theo ý muốn.
• Trong quá trình sắc ký, các chất đợc phân tách trên cơ sở kích thớc và hình dạng của các phân tử trong mẫu phân tích. Những phân tử lớn của pha lỏng không qua dợc các lỗ gel nên di chuyển qua các chỗ trống, đờng đi ngắn hơn nên di chuyển nhanh ra khỏi cột trớc. Các phân tử nhỏ chui qua các lỗ của hạt gel, đờng đi vòng vèo, dài hơn nên di chuyển chậm.
• Sắc ký ái lực: Pha cố định là một chất giá có phân tử lớn, trơ, trên đó gắn một chất ái lực sinh học đặc hiệu với một loại cấu tử hòa tan của mẫu phân tích. ái lực gắn sinh học thờng là các phản ứng kiểu enzym- cơ chất, kháng nguyên- kháng thể.
2.2.2. Phân loại dựa trên hình dạng pha tĩnh.
* Sắc ký trên giấy: Pha tĩnh thường là nớc đợc giữ ở các hạt celulose của tờ giấy.
* Sắc ký lớp mỏng: Pha tĩnh là chất hấp phụ được hòa thành nhũ dịch sau đó trải lên phiến kính thành một lớp mỏng, rồi sấy khô để hoạt hóa.
* Sắc ký cột: Chất liệu làm pha tĩnh được nhồi vào cột. Tùy loại chất liệu tạo cột mà có tất cả các loại sắc ký theo nguyên lý ở trên. Ngoài ra tùy áp lực trên cột trong qúa trình sắc ký mà phân chia thành:
- Sắc ký cột mở: Cột thủy tinh làm sắc ký không có khả năng chịu lực và hệ thống sắc ký được thông tự nhiên với khí trời.
- Sắc ký lỏng cao áp: Cột sắc ký được làm bằng thủy tinh hoặc bằng thép chịu lực. Pha di động được bơm vào cột với áp lực cao trong hệ thống sắc ký kín.
• Sắc ký trên giấy
Đầu tiên, sắc ký trên giấy chỉ dùng để phân tách các aminoacid, nhng sau đó đã đợc phát triển và trở thành một trong những phơng pháp phổ biến nhất trong hóa sinh và trong hóa học nói chung.
1. Nguyên tắc của phơng pháp sắc ký trên giấy:
Hiện tượng hóa lý xảy ra trong sắc ký trên giấy cũng tương tự như trong sắc ký phân bố nói chung, tức là dựa váo sự phân bố khác nhau của các chất giữa 2 pha: pha cố định thường dùng là nước được giữ ở trên giấy sắc ký (ở khí quyển bão hòa hơi nước, giấy có thể giữ tới 15 - 22% nớc tính theo trọng lượng giấy); pha di động thường là một dung môi hữu cơ bão hòa nớc. Dung môi hữu cơ di chuyển trên tờ giấy sắc ký theo mao dẫn. Giấy đóng vai trò là giá tựa cho dung môi cố định (pha cố định).
Trong những điều kiện nhất định (dung môi, nhiệt độ...) mỗi chất được đặc trưng bởi một trị số nhất định gọi là hệ số Rf:
Rf = A/B
A : là khoảng cách di chuyển của chất phân tách.
B : là khoảng cách di chuyển của dung môi.
Có sự tương quan chặt chẽ giữa Rf và hệ số phân bố của chúng trong 2 pha dung môi. Chất nào càng ít tan trong pha cố định (nước ) và tan nhiều trong pha di động (dung môi hữu cơ) thì tốc độ di chuyển càng nhanh, có nghĩa là Rf lớn. Ngược lại, chất nào càng tan nhiều trong pha cố định và tan ít trong pha di động thì tốc độ di chuyển càng chậm, Rf càng nhỏ.
2. Các bước chuẩn bị trong sắc ký giấy:
+ Chuẩn bị mẫu phân tích:
- Mẫu phân tích nào có chất cần phân tích có nồng độ cao và có cách hiện màu nhậy thì có thể cho chạy sắc ký ngay không cần chuẩn bị gì trớc.
- Mẫu phân tích nào có nồng độ chất phân tích loãng hoặc có các tạp chất mà ảnh hởng đến việc tách và hiện màu thì phải cô đặc mẫu và loại bỏ các yếu tố ảnh hởng bằng hút chân không, bằng thẩm tích, kết tủa bằng nhiệt, bằng dung môi hữu cơ...
+ Chọn giấy sắc ký:
• Yêu cầu về giấy nh sau: giấy phải tinh khiết, trung tính về hóa học, đồng nhất về tỷ trọng. Thông thờng dùng các loại giấy Whatman số 1, hoặc Schleicher-Schull 2043 a và b...
• Để tách tốt cần chú ý hớng sợi giấy trùng với hớng chuyển động của dung môi.
• Các loại giấy thường a nớc, do đó nếu dùng nớc làm pha cố định thì không cần phải làm ẩm. Nếu để tách hỗn hợp các chất hữu cơ không tan trong nước, cần chuyển giấy từ a nớc thành kỵ nước bằng cách tẩm các chất kỵ nước khác nhau và acetyl hóa.
+Chọn dung môi:
Chọn dung môi làm pha cố định và pha di động là yếu tố quan trọng nhất để tách các chất trong sắc ký giấy. Dung môi di động thờng là hỗn hợp của một dung môi hữu cơ chính và nước có thể thêm một số thành phần khác như acid hay base để làm tăng hay giảm độ hòa tan của một số chất. Nếu tan nhiều quá trong dung môi di động, chất tan sẽ chuyển động theo tuyến dung môi; nếu tan ít quá, chất phân tách sẽ gần nh không di chuyển và dừng ở ngay vị trí xuất phát. Trong sắc ký aminoacid trên giấy hỗn hợp, dung môi thích hợp nhất là: butanol-acid acetic-nước với tỷ lệ 4:1:5.
3. Kỹ thuật chạy sắc ký
• Trong sắc ký giấy có thể tiến hành sắc ký một chiều đi lên hoặc đi xuống, sắc ký hai chiều hoặc sắc ký vòng nằm ngang. Kỹ thuật chạy sắc ký gồm các bước sau:
+ Chấm mẫu thử :
• Vị trí chấm mẫu thử đợc đánh dấu trớc bằng bút chì, nơi chấm tuỳ thuộc vào kiểu sắc ký và kích thớc bình sắc ký. Giữa các vết chấm phải cách nhau 2,5-3 cm để tránh chập vào nhau khi hiện hình. Vết chấm phải tròn và nhỏ (đờng kính tối đa là 10 mm), hoặc có thể chấm thành vạch ngang.
• Lợng mẫu thử cần chấm tuỳ thuộc vào độ nhậy của thuốc hiện hình. Ví dụ, với aminoacid mỗi loại cần 5-10 mg, các đờng đơn cần 5-50 mg cho mỗi chất.
• Dùng các pipet vi lợng nh loại dùng trong huyết học để chấm. Khi chấm dùng máy sấy tóc để sấy khô mỗi lần chấm. Tốt nhất là làm trên tủ chuẩn bị sắc ký.
+ Chạy sắc ký:
• Trong sắc ký một chiều đi lên, dung môi di động đặt ở đáy bình sắc ký. Đầu tờ giấy có chấm mẫu thử nhúng vào dung môi di động sao cho các vết chấm cách mặt dung môi khoảng 2 cm.
• Trong sắc ký một chiều đi xuống, dung môi di động chứa trong máng đợc treo ở phía trên của bình sắc ký. Đầu giấy có chấm mẫu nhúng vào dung môi di động và vắt qua một đũa thuỷ tinh nằm ngang, dùng đũa thuỷ tinh to khác để chặn tờ giấy cho khỏi tụt xuống.
• Trong trờng hợp sắc ký 2 chiều, chấm mẫu thử vào một góc tờ giấy vuông cách mỗi bờ vài cm. Chạy với dung môi 1. Sau đó lấy tờ giấy ra phơi khô rồi cho chạy với dung môi 2 (có thành phần khác với dung môi 1), chiều chạy của dung môi này thẳng góc với dung môi 1. Sắc ký 2 chiều cho phép tách đợc các chất có cấu tạo hóa học gần giống nhau tức là có Rf rất gần nhau.
• Để đảm bảo bão hòa dung môi trong bình, bình sắc ký phải có nắp đậy thật kín, có thể để trong bình sắc ký cốc đựng nớc đã bão hòa dung môi di động để đảm bảo độ ẩm của giấy.
• Thời gian chạy tuỳ thuộc vào kích thớc của giấy, khi nào dung môi di động di chuyển đến gần hết tờ giấy thì lấy ra đánh dấu bằng bút chì vị trí tiền tuyến của dung môi. Đem sấy khô tờ giấy và làm hiện hình.
• + Hiện hình các vết:
• Sắc ký đồ sau khi chạy xong lấy ra phơi khô cho bay hết dung môi ở nhiệt độ thờng hoặc ở 800C. Nếu dung môi là phenol phải để khô ở nhiệt độ phòng để tránh phá huỷ các chất.
• Hiện hình có thể bằng phơng pháp lý hoặc hóa học. Ví dụ, chất phân tách có thể phát huỳnh quang khi chiếu vào ánh sáng tử ngoại (thờng dùng bớc sóng 254-370 nm). Nhng phổ biến nhất vẫn là hiện hình bằng các thuốc thử hóa học thích hợp. Thuốc thử này đợc phun đều đủ làm ẩm tờ giấy sắc ký, không phun nhiều quá làm ớt sũng tờ giấy. Hoặc tráng nhanh vào thuốc thử hiện màu. Trong trờng hợp sắc ký aminoacid, khi phun thuốc thử ninhydrin xong thờng phải sấy khô ở 80-1000C.
+ Phương pháp xác định các chất:
Có thể xác định các chất bằng các phơng pháp sau:
-Căn cứ vào hệ số Rf để xác định vị trí của từng chất cần phân tách. Tuy nhiên, cùng một hệ dung môi Rf có thể bị ảnh hởng bởi nhiều yếu tố nh là: độ dày, độ xốp, độ tinh khiết của giấy và nhiệt độ cũng ảnh hởng đến sự phân bố giữa 2 pha. Các tạp chất và tỷ lệ các chất trong hỗn hợp dung môi cũng làm thay đổi Rf. Cho nên phơng pháp này ít đợc dùng.
-Thông thờng và chính xác là dùng các chất chuẩn. Các mẫu chuẩn có thể chấm bên cạnh mẫu thử hoặc có thể trộn ngay vào mẫu thử. Đối với mẫu thử mà cha loại hết tạp chất thì việc trộn lẫn mẫu chuẩn vào mẫu thử là rất cần thiết vì Rf có thể bị ảnh hởng bởi các tạp chất nên sẽ gây nhầm lẫn chất nọ với chất kia.
+ Phương pháp định lợng các chất trong sắc ký đồ:
Phương pháp làm thôi màu các vết bằng dung môi thích hợp rồi đo màu là phơng pháp thông dụng và chính xác hơn cả. Cắt các vết màu thành từng phần riêng biệt, nếu vết nào có diện tích lớn thì cắt nhỏ tiếp. Cho các mẫu cắt này vào từng ống nghiệm đã chứa dung môi thôi màu, thỉnh thoảng lắc cho thôi hết màu khỏi giấy sau đó đem đo màu trên quang kế. Đối chiếu với mẫu chuẩn cùng cho chạy sắc ký nh trên để tính kết quả.
-Phương pháp chiết rút các chất ra khỏi giấy:
Có trường hợp phải chiết rút các chất ra khỏi giấy để đảm bảo tính nguyên vẹn về cấu trúc hóa học, không được nhuộm bằng thuốc hiện màu nh trong trờng hợp chiết rút để đo hoạt tính sinh học. Phương pháp này được làm nh sau: trên cùng một tờ giấy sắc ký cho chạy song song ở 2 đầu 2 vết mẫu chuẩn và mẫu thử, một vết mẫu thử nữa ở giữa. Sau khi chạy sắc ký, cắt dọc 2 băng nhỏ ở 2 bên đem hiện hình. Để xác định vị trí các vết cần tìm, dùng 2 băng đã lên màu làm chuẩn để cắt ngang băng có chứa chất nghiên cứu. Cho các mảnh giấy có chứa chất nghiên cứu vào các ống nghiệm có chứa dung môi chiết rút, thỉnh thoảng lắc. Sau đó loại giấy đi. Nếu cần thiết chiết rút 1 lần nữa bằng một ít dung môi trên.
• Sắc ký lớp mỏng
Sắc ký lớp mỏng là một phơng pháp cải biên của sắc ký trên cột và sắc ký trên giấy. Sắc ký lớp mỏng có một số uư điểm như sau:
-Chỉ cần dùng một lượng rất ít mẫu thử.
-Khả năng phân tách tốt hơn sắc ký giấy.
-Thời gian rất nhanh chỉ cần 20-30 phút là đã nhận đợc kết quả.
-Có thể dùng để phân tách các chất kỵ nước như là lipid...
-Có thể dùng thuốc hiện màu acid hay base mạnh ở nhiệt độ cao (100-2000C).
Tuy nhiên, sắc ký lớp mỏng khó bảo quản sắc ký đồ và độ lặp lại của hệ số Rf của các chất rất khó thực hiện.
1. Nguyên tắc của sắc ký lớp mỏng:
Là dựa trên sự phân bố của các chất giữa 2 pha: pha cố định là chất hấp phụ đợc rải rộng trên phiến kính tạo thành một lớp mỏng và pha di động là một dung môi thích hợp. Khi dung môi di chuyển sẽ làm chuyển dịch các thành phần trong mẫu thử. Sau khi dung môi chạy xong, để bay hơi hết dung môi trên sắc ký đồ rồi hiện màu nh trong sắc ký giấy. Nói chung, lý thuyết của sắc ký lớp mỏng là một phần dựa trên lý thuyết của sắc ký hấp phụ và một phần dựa trên lý thuyết sắc ký giấy.
2. Các bước chuẩn bị sắc ký lớp mỏng
+ Chọn chất hấp phụ: cũng tơng tự như sắc ký cột có thể dùng các chất hấp phụ là silicagel, nhôm oxyt, bột cellulose, tinh bột, sephadex...
Để cho chất hấp phụ bám chắc vào phiến kính, ngời ta cho thêm chất dính vào chất hấp phụ. Chất dính thường là CaSO4 với tỷ lệ khoảng 10%.
+ Chuẩn bị phiến kính và lớp mỏng chất hấp phụ trên kính:
Các phiến kính thờng có cỡ 20 ´ 5 cm, 20 ´ 20 cm, 7,5 ´ 2,6 cm. Rửa sạch, sấy khô trớc khi rải. Cân 5 g bột silicagel cho vào cối nghiền đều với 10 ml nớc cất, lợng này có thể rải trên 2 phiến kính cỡ 20 ´ 5 cm. Sau đó rải ngay lên phiến kính bằng tay hoặc bằng máy. Để khô ở nhiệt độ phòng sau đó sấy ở 1000C từ 30 - 120 phút tuỳ theo yêu cầu. Độ dày chuẩn của lớp mỏng là 0,25 - 0,30 mm.
+ Chuẩn bị mẫu thử: cũng giống như sắc ký giấy, các mẫu thử cần có cách chuẩn bị riêng để loại bỏ tạp chất và cô đặc mẫu. Dùng ống vi quản chấm mẫu cách bờ dới phiến kính khoảng 1-2 cm. Vết chấm phải nhỏ, đường kính 2 - 5 mm cách xa nhau ít nhất 1 cm.
3. Chạy sắc ký:
• Sau khi chấm mẫu thử xong cho vào bình sắc ký có kích thước thích hợp, đậy nút mài hoặc nắp kín.
• Đầu dưới phiến kính ngập vào dung môi khoảng 0,5 - 1 cm (vết mẫu thử không ngập vào dung môi). Để bão hòa dung môi trong bình, có thể lót giấy lọc xung quanh bình để dung môi thấm đều trên khắp tờ giấy.
• Khi dung môi di chuyển lên phiến kính sắc ký lớp mỏng đợc 10-11 cm thì lấy ra, đánh dấu tiền tuyến dung môi rồi để bay hơi hết dung môi ở nhiệt độ phòng.
• Sắc ký lớp mỏng có thể chạy đi lên (thông dụng nhất), đi xuống hoặc 2 chiều như sắc ký giấy.
4. Phát hiện các vết trên sắc ký đồ:
• Nói chung, các phơng pháp phát hiện các chất trên sắc ký lớp mỏng cũng tơng tự nh sắc ký giấy. Phơng pháp tốt nhất vẫn là nên chạy song song những chất mẫu chuẩn trên cùng phiến kính đó. Việc dựa vào Rf trong sắc ký lớp mỏng còn kém tin cậy hơn sắc ký giấy.
• Để phát hiện các chất hữu cơ, có thể dùng hơi iod. Đặt phiến kính vào bình kín trong đó để một ít tinh thể iod. Sau một thời gian ngắn, nền sẽ có màu tím, còn các hợp chất cha no sẽ không màu, các hợp chất no khác có màu nâu.
• Việc định lượng các chất cũng tơng tự như sắc ký giấy nh: đo diện tích của vết màu, đo màu bằng densitometer. Cách tương đối chính xác nhất là cạo vùng sắc ký đồ có vết cần phân tích, sau đó dùng dung môi thích hợp để chiết rút rồi làm phản ứng màu.