Sắc ký là một trong những phư­ơng pháp quan trọng trong các phư­ơng pháp phân tích hóa sinh. Sắc ký đ­ược áp dụng rất rộng rãi với nhiều mục đích khác nhau nh­ là đ­ược sử dụng để định tính, định lư­ợng, điều chế các chất tinh khiết, xác định các hằng số hóa lý, nghiên cứu các quá trình động học và xúc tác... Ngoài ra nó còn đư­ợc áp dụng ở các ngành có liên quan tới hóa học như­ y d­ược, nông nghiệp, thực phẩm, bảo vệ môi trư­ờng, luyện kim, dầu mỏ địa chất...

Sắc ký là sự tách liên tục các chất từ hỗn hợp các chất do sự phân bố không đồng đều của chúng gĩ­a pha cố định (pha tĩnh) và pha di động khi cho pha di động đi xuyên qua pha cố định .

Gồm 2 loại cơ bản:- Sắc ký khí

- Sắc ký lỏng

2.1. Sắc ký khí: Pha di dộng là một chất khí.

- Mẫu phân tích đ­ợc hóa hơi ở nhiệt độ cao và nhờ có khí chứa trong bom khí dẫn vào cột phân tách nằm trong buồng điều nhiệt và quá trình phân tích các chất diễn ra ở đây.

- Cột sắc ký th­ờng có đ­ờng kính rất nhỏ ( vài mm) và xoắn lò so trong buồng điều nhiệt. Tùy theo pha tĩnh ng­ời ta phân ra các loại sắc ký khí khác nhau.

Pha tĩnh là một chất rắn và cơ chế phân tách các chất dựa trên nguyên lý của sắc ký hấp phụ.

Pha tĩnh là một chất lỏng và cơ chế phân tách các chất dựa trên nguyên lý của sắc ký phân bố.

Sắc ký khí th­ường dùng trong phân tích, phát hiện các chất và sử dụng cột sắc ký chuyên dụng. Ph­ương pháp này có ­u điểm là thời gian ngắn, l­ượng mẫu ít, độ chính xác cao.

Pha động là chất lỏng. Có nhiều cách phân loại khác nhau.

2.2.1. Dựa trên đặc tính của pha tĩnh (cơ chế của quá trình phân tách), có các loại sắc ký sau:

*Sắc ký hấp phụ: Sự phân tách các chất là do ái lực khác nhau của chất phân tách đối với chất hấp phụ là chất rắn (pha cố định).

* Sắc ký trao đổi ion: Sự phân tách các ion là do các ion đ­ợc phân tách trong dung dịch có ái lực khác nhau với các trung tâm trao đổi ion (nhóm chứa ion) trên chất rắn là pha cố định. Các chất đó gọi là các chất trao đổi ion mà thông th­ờng nhất là các nhựa trao đổi ion.

- Gắn chất phân tích mang điện ( hòa tan trong pha động ) và ion mang điện tích trái dấu ở pha cố định.

- Đẩy chất phân tích mang điện đ­ợc giữ trên pha tĩnh bằng một dung dịch chứa chất mang điện tích khác ( Dung dịch đẩy) có ái lực liên kết ion với pha tĩnh lớn hơn chất phân tích.

phân bố: Pha tĩnh là một chất lỏng, còn gọi là sắc ký lỏng-lỏng.

• Các chất đ­ợc phân tách dựa trên sự phân bố khác nhau của mỗi chất hòa tan vào 2 pha lỏng không trộn lẫn với nhau. Mỗi chất có hệ số phân bố riêng trong một hệ dung môi nhất định.

• K= Cs / Cm.

• Cs : nồng độ chất trong pha tĩnh.

• Cm: Nồng độ chất trong pha động.

• K: Đại l­ợng đặc tr­ng cho từng chất phụ thuộc vào bản chất chất tan và nhiệt độ.

• K càng lớn, chất di chuyển càng chậm.

*Sắc ký lọc gel: Còn gọi là sắc ký sàng phân tử trên cơ sở chất liệu hạt gel xốp với kích th­ớc hạt gel cũng nh­ lỗ hạt gel có thể tạo ra theo ý muốn.

• Trong quá trình sắc ký, các chất đ­ợc phân tách trên cơ sở kích th­ớc và hình dạng của các phân tử trong mẫu phân tích. Những phân tử lớn của pha lỏng không qua d­ợc các lỗ gel nên di chuyển qua các chỗ trống, đ­ờng đi ngắn hơn nên di chuyển nhanh ra khỏi cột tr­ớc. Các phân tử nhỏ chui qua các lỗ của hạt gel, đ­ờng đi vòng vèo, dài hơn nên di chuyển chậm.

• Sắc ký ái lực: Pha cố định là một chất giá có phân tử lớn, trơ, trên đó gắn một chất ái lực sinh học đặc hiệu với một loại cấu tử hòa tan của mẫu phân tích. ái lực gắn sinh học th­ờng là các phản ứng kiểu enzym- cơ chất, kháng nguyên- kháng thể.

* Sắc ký trên giấy: Pha tĩnh thư­ờng là n­ớc đ­ợc giữ ở các hạt celulose của tờ giấy.

* Sắc ký lớp mỏng: Pha tĩnh là chất hấp phụ đ­ược hòa thành nhũ dịch sau đó trải lên phiến kính thành một lớp mỏng, rồi sấy khô để hoạt hóa.

* Sắc ký cột: Chất liệu làm pha tĩnh đư­ợc nhồi vào cột. Tùy loại chất liệu tạo cột mà có tất cả các loại sắc ký theo nguyên lý ở trên. Ngoài ra tùy áp lực trên cột trong qúa trình sắc ký mà phân chia thành:

- Sắc ký cột mở: Cột thủy tinh làm sắc ký không có khả năng chịu lực và hệ thống sắc ký đư­ợc thông tự nhiên với khí trời.

- Sắc ký lỏng cao áp: Cột sắc ký đ­ược làm bằng thủy tinh hoặc bằng thép chịu lực. Pha di động đư­ợc bơm vào cột với áp lực cao trong hệ thống sắc ký kín.

• Sắc ký trên giấy

Đầu tiên, sắc ký trên giấy chỉ dùng để phân tách các aminoacid, nh­ng sau đó đã đ­ợc phát triển và trở thành một trong những ph­ơng pháp phổ biến nhất trong hóa sinh và trong hóa học nói chung.

Hiện tư­ợng hóa lý xảy ra trong sắc ký trên giấy cũng tư­ơng tự như­ trong sắc ký phân bố nói chung, tức là dựa váo sự phân bố khác nhau của các chất giữa 2 pha: pha cố định th­ường dùng là nư­ớc đư­ợc giữ ở trên giấy sắc ký (ở khí quyển bão hòa hơi n­ước, giấy có thể giữ tới 15 - 22% n­ớc tính theo trọng lư­ợng giấy); pha di động th­ường là một dung môi hữu cơ bão hòa n­ớc. Dung môi hữu cơ di chuyển trên tờ giấy sắc ký theo mao dẫn. Giấy đóng vai trò là giá tựa cho dung môi cố định (pha cố định).

Trong những điều kiện nhất định (dung môi, nhiệt độ...) mỗi chất đư­ợc đặc trư­ng bởi một trị số nhất định gọi là hệ số Rf:

Rf = A/B

A : là khoảng cách di chuyển của chất phân tách.

B : là khoảng cách di chuyển của dung môi.

Có sự t­ương quan chặt chẽ giữa Rf và hệ số phân bố của chúng trong 2 pha dung môi. Chất nào càng ít tan trong pha cố định (n­ước ) và tan nhiều trong pha di động (dung môi hữu cơ) thì tốc độ di chuyển càng nhanh, có nghĩa là Rf lớn. Ngư­ợc lại, chất nào càng tan nhiều trong pha cố định và tan ít trong pha di động thì tốc độ di chuyển càng chậm, Rf càng nhỏ.

+ Chuẩn bị mẫu phân tích:

- Mẫu phân tích nào có chất cần phân tích có nồng độ cao và có cách hiện màu nhậy thì có thể cho chạy sắc ký ngay không cần chuẩn bị gì tr­ớc.

- Mẫu phân tích nào có nồng độ chất phân tích loãng hoặc có các tạp chất mà ảnh h­ởng đến việc tách và hiện màu thì phải cô đặc mẫu và loại bỏ các yếu tố ảnh h­ởng bằng hút chân không, bằng thẩm tích, kết tủa bằng nhiệt, bằng dung môi hữu cơ...

• Yêu cầu về giấy nh­ sau: giấy phải tinh khiết, trung tính về hóa học, đồng nhất về tỷ trọng. Thông th­ờng dùng các loại giấy Whatman số 1, hoặc Schleicher-Schull 2043 a và b...

• Để tách tốt cần chú ý h­ớng sợi giấy trùng với h­ớng chuyển động của dung môi.

• Các loại giấy th­ường ­a n­ớc, do đó nếu dùng n­ớc làm pha cố định thì không cần phải làm ẩm. Nếu để tách hỗn hợp các chất hữu cơ không tan trong nư­ớc, cần chuyển giấy từ ­a n­ớc thành kỵ n­ước bằng cách tẩm các chất kỵ n­ước khác nhau và acetyl hóa.

Chọn dung môi làm pha cố định và pha di động là yếu tố quan trọng nhất để tách các chất trong sắc ký giấy. Dung môi di động th­ờng là hỗn hợp của một dung môi hữu cơ chính và nư­ớc có thể thêm một số thành phần khác như­ acid hay base để làm tăng hay giảm độ hòa tan của một số chất. Nếu tan nhiều quá trong dung môi di động, chất tan sẽ chuyển động theo tuyến dung môi; nếu tan ít quá, chất phân tách sẽ gần nh­ không di chuyển và dừng ở ngay vị trí xuất phát. Trong sắc ký aminoacid trên giấy hỗn hợp, dung môi thích hợp nhất là: butanol-acid acetic-n­ước với tỷ lệ 4:1:5.

• Trong sắc ký giấy có thể tiến hành sắc ký một chiều đi lên hoặc đi xuống, sắc ký hai chiều hoặc sắc ký vòng nằm ngang. Kỹ thuật chạy sắc ký gồm các b­ước sau:

+ Chấm mẫu thử :

• Vị trí chấm mẫu thử đ­ợc đánh dấu tr­ớc bằng bút chì, nơi chấm tuỳ thuộc vào kiểu sắc ký và kích th­ớc bình sắc ký. Giữa các vết chấm phải cách nhau 2,5-3 cm để tránh chập vào nhau khi hiện hình. Vết chấm phải tròn và nhỏ (đ­ờng kính tối đa là 10 mm), hoặc có thể chấm thành vạch ngang.

• L­ợng mẫu thử cần chấm tuỳ thuộc vào độ nhậy của thuốc hiện hình. Ví dụ, với aminoacid mỗi loại cần 5-10 mg, các đ­ờng đơn cần 5-50 mg cho mỗi chất.

• Dùng các pipet vi l­ợng nh­ loại dùng trong huyết học để chấm. Khi chấm dùng máy sấy tóc để sấy khô mỗi lần chấm. Tốt nhất là làm trên tủ chuẩn bị sắc ký.

+ Chạy sắc ký:

• Trong sắc ký một chiều đi lên, dung môi di động đặt ở đáy bình sắc ký. Đầu tờ giấy có chấm mẫu thử nhúng vào dung môi di động sao cho các vết chấm cách mặt dung môi khoảng 2 cm.

• Trong sắc ký một chiều đi xuống, dung môi di động chứa trong máng đ­ợc treo ở phía trên của bình sắc ký. Đầu giấy có chấm mẫu nhúng vào dung môi di động và vắt qua một đũa thuỷ tinh nằm ngang, dùng đũa thuỷ tinh to khác để chặn tờ giấy cho khỏi tụt xuống.

• Trong tr­ờng hợp sắc ký 2 chiều, chấm mẫu thử vào một góc tờ giấy vuông cách mỗi bờ vài cm. Chạy với dung môi 1. Sau đó lấy tờ giấy ra phơi khô rồi cho chạy với dung môi 2 (có thành phần khác với dung môi 1), chiều chạy của dung môi này thẳng góc với dung môi 1. Sắc ký 2 chiều cho phép tách đ­ợc các chất có cấu tạo hóa học gần giống nhau tức là có Rf rất gần nhau.

• Để đảm bảo bão hòa dung môi trong bình, bình sắc ký phải có nắp đậy thật kín, có thể để trong bình sắc ký cốc đựng n­ớc đã bão hòa dung môi di động để đảm bảo độ ẩm của giấy.

• Thời gian chạy tuỳ thuộc vào kích th­ớc của giấy, khi nào dung môi di động di chuyển đến gần hết tờ giấy thì lấy ra đánh dấu bằng bút chì vị trí tiền tuyến của dung môi. Đem sấy khô tờ giấy và làm hiện hình.

• + Hiện hình các vết:

• Sắc ký đồ sau khi chạy xong lấy ra phơi khô cho bay hết dung môi ở nhiệt độ th­ờng hoặc ở 800C. Nếu dung môi là phenol phải để khô ở nhiệt độ phòng để tránh phá huỷ các chất.

• Hiện hình có thể bằng ph­ơng pháp lý hoặc hóa học. Ví dụ, chất phân tách có thể phát huỳnh quang khi chiếu vào ánh sáng tử ngoại (th­ờng dùng b­ớc sóng 254-370 nm). Nh­ng phổ biến nhất vẫn là hiện hình bằng các thuốc thử hóa học thích hợp. Thuốc thử này đ­ợc phun đều đủ làm ẩm tờ giấy sắc ký, không phun nhiều quá làm ­ớt sũng tờ giấy. Hoặc tráng nhanh vào thuốc thử hiện màu. Trong tr­ờng hợp sắc ký aminoacid, khi phun thuốc thử ninhydrin xong th­ờng phải sấy khô ở 80-1000C.

+ Ph­ương pháp xác định các chất:

Có thể xác định các chất bằng các ph­ơng pháp sau:

-Căn cứ vào hệ số Rf để xác định vị trí của từng chất cần phân tách. Tuy nhiên, cùng một hệ dung môi Rf có thể bị ảnh h­ởng bởi nhiều yếu tố nh­ là: độ dày, độ xốp, độ tinh khiết của giấy và nhiệt độ cũng ảnh h­ởng đến sự phân bố giữa 2 pha. Các tạp chất và tỷ lệ các chất trong hỗn hợp dung môi cũng làm thay đổi Rf. Cho nên ph­ơng pháp này ít đ­ợc dùng.

-Thông th­ờng và chính xác là dùng các chất chuẩn. Các mẫu chuẩn có thể chấm bên cạnh mẫu thử hoặc có thể trộn ngay vào mẫu thử. Đối với mẫu thử mà ch­a loại hết tạp chất thì việc trộn lẫn mẫu chuẩn vào mẫu thử là rất cần thiết vì Rf có thể bị ảnh h­ởng bởi các tạp chất nên sẽ gây nhầm lẫn chất nọ với chất kia.

+ Phư­ơng pháp định l­ợng các chất trong sắc ký đồ:

Phư­ơng pháp làm thôi màu các vết bằng dung môi thích hợp rồi đo màu là ph­ơng pháp thông dụng và chính xác hơn cả. Cắt các vết màu thành từng phần riêng biệt, nếu vết nào có diện tích lớn thì cắt nhỏ tiếp. Cho các mẫu cắt này vào từng ống nghiệm đã chứa dung môi thôi màu, thỉnh thoảng lắc cho thôi hết màu khỏi giấy sau đó đem đo màu trên quang kế. Đối chiếu với mẫu chuẩn cùng cho chạy sắc ký nh­ trên để tính kết quả.

-Phư­ơng pháp chiết rút các chất ra khỏi giấy:

Có trư­ờng hợp phải chiết rút các chất ra khỏi giấy để đảm bảo tính nguyên vẹn về cấu trúc hóa học, không đư­ợc nhuộm bằng thuốc hiện màu nh­ trong tr­ờng hợp chiết rút để đo hoạt tính sinh học. Ph­ương pháp này đư­ợc làm nh­ sau: trên cùng một tờ giấy sắc ký cho chạy song song ở 2 đầu 2 vết mẫu chuẩn và mẫu thử, một vết mẫu thử nữa ở giữa. Sau khi chạy sắc ký, cắt dọc 2 băng nhỏ ở 2 bên đem hiện hình. Để xác định vị trí các vết cần tìm, dùng 2 băng đã lên màu làm chuẩn để cắt ngang băng có chứa chất nghiên cứu. Cho các mảnh giấy có chứa chất nghiên cứu vào các ống nghiệm có chứa dung môi chiết rút, thỉnh thoảng lắc. Sau đó loại giấy đi. Nếu cần thiết chiết rút 1 lần nữa bằng một ít dung môi trên.

• Sắc ký lớp mỏng

Sắc ký lớp mỏng là một ph­ơng pháp cải biên của sắc ký trên cột và sắc ký trên giấy. Sắc ký lớp mỏng có một số ­uư điểm như­ sau:

-Chỉ cần dùng một l­ượng rất ít mẫu thử.

-Khả năng phân tách tốt hơn sắc ký giấy.

-Thời gian rất nhanh chỉ cần 20-30 phút là đã nhận đ­ợc kết quả.

-Có thể dùng để phân tách các chất kỵ nư­ớc nh­ư là lipid...

-Có thể dùng thuốc hiện màu acid hay base mạnh ở nhiệt độ cao (100-2000C).

Tuy nhiên, sắc ký lớp mỏng khó bảo quản sắc ký đồ và độ lặp lại của hệ số Rf của các chất rất khó thực hiện.

Là dựa trên sự phân bố của các chất giữa 2 pha: pha cố định là chất hấp phụ đ­ợc rải rộng trên phiến kính tạo thành một lớp mỏng và pha di động là một dung môi thích hợp. Khi dung môi di chuyển sẽ làm chuyển dịch các thành phần trong mẫu thử. Sau khi dung môi chạy xong, để bay hơi hết dung môi trên sắc ký đồ rồi hiện màu nh­ trong sắc ký giấy. Nói chung, lý thuyết của sắc ký lớp mỏng là một phần dựa trên lý thuyết của sắc ký hấp phụ và một phần dựa trên lý thuyết sắc ký giấy.

+ Chọn chất hấp phụ: cũng t­ơng tự như­ sắc ký cột có thể dùng các chất hấp phụ là silicagel, nhôm oxyt, bột cellulose, tinh bột, sephadex...

Để cho chất hấp phụ bám chắc vào phiến kính, ng­ời ta cho thêm chất dính vào chất hấp phụ. Chất dính thư­ờng là CaSO4 với tỷ lệ khoảng 10%.

+ Chuẩn bị phiến kính và lớp mỏng chất hấp phụ trên kính:

Các phiến kính th­ờng có cỡ 20 ´ 5 cm, 20 ´ 20 cm, 7,5 ´ 2,6 cm. Rửa sạch, sấy khô tr­ớc khi rải. Cân 5 g bột silicagel cho vào cối nghiền đều với 10 ml n­ớc cất, l­ợng này có thể rải trên 2 phiến kính cỡ 20 ´ 5 cm. Sau đó rải ngay lên phiến kính bằng tay hoặc bằng máy. Để khô ở nhiệt độ phòng sau đó sấy ở 1000C từ 30 - 120 phút tuỳ theo yêu cầu. Độ dày chuẩn của lớp mỏng là 0,25 - 0,30 mm.

+ Chuẩn bị mẫu thử: cũng giống như­ sắc ký giấy, các mẫu thử cần có cách chuẩn bị riêng để loại bỏ tạp chất và cô đặc mẫu. Dùng ống vi quản chấm mẫu cách bờ d­ới phiến kính khoảng 1-2 cm. Vết chấm phải nhỏ, đư­ờng kính 2 - 5 mm cách xa nhau ít nhất 1 cm.

• Sau khi chấm mẫu thử xong cho vào bình sắc ký có kích thư­ớc thích hợp, đậy nút mài hoặc nắp kín.

• Đầu dư­ới phiến kính ngập vào dung môi khoảng 0,5 - 1 cm (vết mẫu thử không ngập vào dung môi). Để bão hòa dung môi trong bình, có thể lót giấy lọc xung quanh bình để dung môi thấm đều trên khắp tờ giấy.

• Khi dung môi di chuyển lên phiến kính sắc ký lớp mỏng đ­ợc 10-11 cm thì lấy ra, đánh dấu tiền tuyến dung môi rồi để bay hơi hết dung môi ở nhiệt độ phòng.

• Sắc ký lớp mỏng có thể chạy đi lên (thông dụng nhất), đi xuống hoặc 2 chiều như­ sắc ký giấy.

• Nói chung, các ph­ơng pháp phát hiện các chất trên sắc ký lớp mỏng cũng t­ơng tự nh­ sắc ký giấy. Ph­ơng pháp tốt nhất vẫn là nên chạy song song những chất mẫu chuẩn trên cùng phiến kính đó. Việc dựa vào Rf trong sắc ký lớp mỏng còn kém tin cậy hơn sắc ký giấy.

• Để phát hiện các chất hữu cơ, có thể dùng hơi iod. Đặt phiến kính vào bình kín trong đó để một ít tinh thể iod. Sau một thời gian ngắn, nền sẽ có màu tím, còn các hợp chất ch­a no sẽ không màu, các hợp chất no khác có màu nâu.

• Việc định lư­ợng các chất cũng t­ơng tự như­ sắc ký giấy nh­: đo diện tích của vết màu, đo màu bằng densitometer. Cách t­ương đối chính xác nhất là cạo vùng sắc ký đồ có vết cần phân tích, sau đó dùng dung môi thích hợp để chiết rút rồi làm phản ứng màu.