Nuôi cấy amip

[tuyenlab]

Từ năm 1896, một số tác giả đã nuôi cấy amip gây bệnh trên môi trường nhân tạo.Nguyên tắc nuôi cấy của các tác giả đó là tạo ra một nền rắn trong ống nuôi cấy sau đó phủ lên nền rắn một dịch nuôi dưỡng có muối và albumin. Amip sẽ phát triển ở phần đáy và phần mặt của môi trường. Từ nguyên tắc trên, một số tác giả khác như Dorset đã dùng huyết thanh đông làm nền rắn, Brumpt đã dùng tinh bột để dễ nuôi cấy và gần đây, một số môi trường cải tiến hơn đã được dùng để nuôi cấy amip.

1. Môi trường có nền (môi trường 2 pha):
Nền của môi trường thường được làm bằng thạch, huyết thanh đông, môi trường trứng đông, môi trường thạch máu: phần lỏng của môi trường là nước muối sinh lý và các thành phần dinh dưỡng của amip như dung dịch Ringer, huyết thanh ngựa, tinh bột gạo. Các môi trường có nền thường được dùng là:

- Môi trường trứng đông:
+ Phần đặc:
• Trứng gà 3 quả
• Dung dịch Ringer: 30ml
Đập trứng gà vào bình thuỷ tinh có sẵn những viên bi vô khuẩn, cho tiếp dung dịch Ringer, lắc đều cho bi đánh tan trứng, đổ vào ống nghiệm 22cm mỗi ống có số trứng cao khoảng 2- 3cm. Để ống nằm nghiêng vào nồi hấp, hấp ở 75- 80oC trong 1 giờ. Bảo quản trong tủ lạnh.
+ Phần lỏng: Gồm dung dịch Ringer và lòng trắng trứng trộn kỹ với nhau, chỉnh pH 7,2- 7,4 (1 lòng trắng trứng + 2000ml Ringer).
Khi nuôi cấy amip mới cho phần lỏng vào phần đặc của môi trường.

- Môi trường thạch máu:
+ Phần đặc:
• NaCl : 6g.
• Thạch: 14g.
• Nước cất: 900ml
• Máu thỏ, bò, cừu: 300ml
+ Phần lỏng: Dung dịch Ringer hoặc dung dịch nước trứng Boeck.
Hoà các thành phần của phần đặc môi trường rồi hấp 120oC/ 30phút. Khi môi trường nguội 50oC thì cho máu vào, đổ ống nghiệm. Khi nuôi cấy lại hấp lại ống môi trường ở 100oC/ 20 phút, để nghiêng cho đông. Cho thêm phần lỏng của môi trường khi nuôi cấy.

- Môi trường Pobell và Laidlaw: môi trường gồm 2 phần:
+ Phần đặc là huyết thanh ngựa làm đông.
+ Phần lỏng là nước trứng Boeck và chất nuôi dưỡng là tinh bột gạo đã tiệt khuẩn (1 lòng trắng trứng + 2000ml dung dịch Ringer).
Cách làm huyết thanh ngựa: Phân phối huyết thanh ngựa ra ống nghiệm 22cm, mỗi ống 5ml. Để ống nằm nghiêng vào nồi hấp, hấp ở 80oC/ 1giờ.
- Môi trường Simitch: Simitch đã thay thế huyết thanh đông bằng 1 phần huyết thanh Loeffler (glucose 10g, pepton 20g, NaCl 5g, thịt bò 500g, nước cất 1000ml) và 3 phần huyết thanh ngựa. Phần nước của môi trường là dung dịch Ringer có pH 7,4. Khi nuôi cấy cho thêm tinh bột gạo.

2. Môi trường thuần nhất (môi trường 1 pha):

Là môi trường gồm nước muối sinh lý và hoà tan trong đó là những phức hợp có nguồn gốc protein như pepton, các tinh chất gan, axit amin, vitamin, cholesterol, huyết cầu tố, bilirubin…Các môi trường thuần nhất thường đ-ược dùng như:

- Môi trường Lamy: Có thể dùng các môi trường sau:
+ Hoà tan 4 lòng trắng trứng gà trong 1000ml dung dịch Ringer.
+ Huyết thanh ngựa + dung dịch Ringer theo tỷ lệ 1+ 8. Sau đó nghiền phôi gà cho vào môi trường để nuôi dưỡng amip (0,1g cho 5ml môi trường). Các môi trường đều có pH 7,4- 7,8.

- Môi trường Balamuth:
+ Lòng trắng trứng gà đã luộc: 2 quả.
+ Nước muối sinh lý: 125ml.
Thái nhỏ lòng trắng trứng gà cho vào nước muối sinh lý, đun sôi 10 phút sau cho thêm nước cất cho đủ 125ml. Hấp 120oC/ 20phút. Lọc qua giấy lọc, điều chỉnh pH 7,6. Sau đó đổ môi trường vào các ống nghiệm hấp 110oC/ 15phút, khi dùng cho thêm tinh bột gạo.

- Môi trường Palova:
+ NaCl: 4,25g
+ Na2HPO4: 0,30g
+ KH2PO4: 0,23g
+ Nước cất: 500ml.
Hoà tan các chất rồi hấp 120oC/ 20phút, sau đó đóng ống nghiệm, mỗi ống 9,5ml, khi cấy cho thêm 0,5ml huyết thanh ngựa tươi và 5mg tinh bột gạo vô khuẩn.

3. Môi trường đặc biệt.
Môi trường đặc biệt dùng để nghiên cứu sinh thái của amip. Có thể dùng các môi trường sau:
- Môi trường Dolkart: Là môi trường thuần nhất được điều chế từ chất mucin dạ dầy có thêm tinh bột gạo.

- Môi trường Snyder: Môi trường này dùng để nghiên cứu tính di động của amip. Môi truờng gồm 2 phần:
Phần đặc:
+Huyết thanh ngựa: 25ml
+Men bia tự tiêu: 2,5g
+Protease- Pepton: 0,5g
+Lacto- apha: 1,5g
+Cholesterol: 0,1mg.
Hoà tan các thành phần trên, hấp 110oC/ 20phút.
Phần lỏng: Dung dịch Ringer: 75ml.

- Môi trường Kessel: Môi truờng này dùng để amip chuyển từ dạng hoạt động thành bào nang. Môi trường gồm 2 phần đặc và lỏng, phần đặc gồm thạch có tinh chất gan, phần lỏng gồm 1 phần huyết thanh ngựa làm mất hoạt tính và 10 phần dung dịch Ringer. Khi nuôi cấy gây hiện tượng thành bào nang thì cần cho thêm tinh bột gạo.

[star]

mọi người cho em hỏi là soi tươi amip thì nhận diện thể hoạt động như thế nào ạ. cảm ơn mọi người

[tuyenlab]

mọi người cho em hỏi là soi tươi amip thì nhận diện thể hoạt động như thế nào ạ. cảm ơn mọi người

1.Amip gây bệnh (Entamoeba histolytica)
1.1. Thể hoạt động ăn hồng cầu gây bệnh (thể magna)
- Hình dạng dài và thay đổi khi di chuyển. Di chuyển bằng cách tạo chân giả.
- Kích thước: 20-40 m
- Nguyên sinh chất: Ngoại nguyên sinh chất là nơi tạo thành chân giả. Nội nguyên sinh chất chứa những hạt mịn là nơi chứa nhân, hồng cầu và các không bào.
- Nhân: Nằm ở nội nguyên sinh chất, xung quanh nhân có hạt nhiễm sắc ngoại vi (chromatin), giữa tâm nhân có hạt trung thể.

1.2. Thể hoạt động chưa ăn hồng cầu, chưa gây bệnh (thể minuta)
- Hình dạng tròn, ít di chuyển.
- Kích thước 12- 20 m.
Không phân biệt rõ nội và ngoại nguyên sinh chất.
Trong nguyên sinh chất không có hồng cầu.
- Hạt nhiễm sắc ngoại vi của nhân dày, rõ.

2. Amip không gây bệnh (Entamoeba coli)
2.1. Thể hoạt động:
- Hình bầu dục, kéo dài khi di chuyển, di chuyển chậm.
- Kích thước lớn hơn amip gây bệnh, 12-50m.
- Không phân biệt rõ ngoại nguyên sinh chất và nội nguyên sinh chất.
- Nhân: Hạt nhiễm sắc ngoại vi không đều, thô, trung thể nằm lệch nhân tâm.
- Trong nguyên sinh chất không có hồng cầu, có những mảnh thức ăn, vi khuẩn, tạp khuẩn.