ĐẾM SỐ LƯỢNG TIỂU CẦU
(Bằng kính hiển vi quang học)
1. Nguyên tắc:
Đếm số lượng tiểu cầu của máu toàn phần trong một thể tích đã biết với một tỷ lệ pha loãng nhất định để tính ra số lượng tiểu cầu trong một lít máu toàn phần.
2. Máu xét nghiệm, hoá chất và dụng cụ:
- Máu tĩnh mạch hoặc mao mạch chưa kịp đông hay đã được chống đông bằng EDTA khô 1,5mg/ml (tốt nhất khi bệnh nhân chưa ăn sáng).
- Dụng cụ lấy máu mao mạch (đầu ngón tay) và tĩnh mạch.
- Dung dịch amoni oxalat hoặc dung dịch Marcano.
- Quả bóp cao su.
- Ống pha loãng (potain) hồng cầu, loại pha loãng 200 lần hoặc potain bạch cầu loại pha loãng 20 lần .
- Buồng đếm, lamen.
- Kính hiển vi đối pha hoặc kính hiển vi quang học.
3. Kỹ thuật đếm trực tiếp:
3.1. Pha loãng tiểu cầu bằng dung dịch Marcano:
Lắc kỹ ống máu, nếu chích đầu ngón tay thì nhớ thấm bỏ giọt đầu. Dùng potain hồng cầu hút máu đến vạch 0,5. Lau sạch đầu ống hút, chú ý không để máu trong ống hút bị thiếu do động tác này. Sau đó hút tiếp dung dịch Marcano đến vạch 101 ở phía trên bầu (độ pha loãng 1/200), bỏ quả bóp ra, dùng ngón tay cái và trỏ (hoặc giữa) bịt chặt hai đầu potain, lắc theo chiều dọc potain khoảng 3-5 phút. Chú ý không để có bọt khi hút máu và dung dịch pha loãng, không hút máu quá vạch chuẩn, không được để mất máu khi hút dung dịch pha loãng.
Trường hợp bệnh nhân giảm tiểu cầu, có thể hút máu đến vạch 1, sau đó hút dung dịch pha loãng đến vạch 101 (độ pha loãng 1/100).
3.2. Pha loãng tiểu cầu bằng dung dịch Amoni oxalat:
Lắc kỹ ống máu, nếu chích đầu ngón tay thì nhớ thấm bỏ giọt đầu. Dùng potain bạch cầu hút máu đến vạch 0,5. Lau sạch đầu ống hút, chú ý không để máu trong ống hút bị thiếu do động tác này. Sau đó hút tiếp dung dịch amoni oxalat đến vạch 11 ở phía trên bầu (độ pha loãng 1/20), bỏ quả bóp ra, dùng ngón tay cái và trỏ (hoặc giữa) bịt chặt hai đầu potain, lắc theo chiều dọc potain khoảng 3-5 phút để hồng cầu tan hết. Chú ý không để có bọt khi hút máu và dung dịch pha loãng, không hút máu quá vạch chuẩn, không được để mất máu khi hút dung dịch pha loãng.
Trường hợp bệnh nhân giảm tiểu cầu, có thể hút máu đến vạch 1, sau đó hút dung dịch pha loãng đến vạch 11 (độ pha loãng 1/10).
3.3. Đếm số lượng tiểu cầu:
Gắn lamen lên buồng đếm khô, sạch. Sau khi lắc kỹ, bỏ một vài giọt đầu, để đầu dưới potain sát cạnh lamen, nhỏ một giọt to đầy buồng đếm nhưng không tràn ra ngoài, đợi 10 phút. Dùng vật kính x10 đếm số lượng tiểu cầu.
Khu vực đếm tiểu cầu chính là khu vực đếm hồng cầu trên buồng đếm. Có nhiều loại buồng đếm khác nhau như Goriaep, Malassez, Thoma, Neubauer và Smic, nhưng có đặc điểm chung khi đếm tiểu cầu là đều đếm 5 khu vực (5 ô vuông lớn), trong đó 4 khu vực ở bốn góc và 1 khu vực ở giữa buồng đếm. Mỗi khu vực đếm gồm 16 ô vuông nhỏ. Mỗi ô vuông nhỏ có thể tích là 1/4000 mm[sup]3[/sup]. Bằng vật kính x 10, đếm tất cả tiểu cầu (chấm sáng nhỏ bằng 1/10 hồng cầu, cần phân biệt với các hạt mỡ) nằm gọn trong khu vực ô vuông lớn và các tiểu cầu nằm trên hai cạnh của mỗi ô vuông lớn.
3.4. Tính kết quả:
Gọi n là tổng số lượng tiểu cầu trên 5 khu vực đếm, độ pha loãng là 1/200. N là số lượng tiểu cầu trong một lít máu, thì :
N = n x 200 x 4000 /80 x 10^6 = n x 10^10 / lit
Nếu độ pha loãng là 1/20 thì:
N = n x 20 x 4000 /80 x 10^6 = n x 10^9/lit.
4. Kỹ thuật gián tiếp:
Đếm số lượng tiểu cầu thông qua tỷ lệ phân bố bạch cầu/tiểu cầu trên tiêu bản nhuộm giemsa và số lượng bạch cầu của chính mẫu máu đó.
Phương pháp này tuy có sai số lớn nhưng nó có vai trò bổ sung hiệu quả cho phương pháp đếm số lượng tiểu cầu trực tiếp, ngay cả khi đếm tiểu cầu bằng máy đếm tế bào.
5. Nguyên nhân sai số:
- Máu xét nghiệm không đúng qui cách: đông dây, máu mao mạch bị pha loãng bởi dịch gian bào do nặn bóp đầu ngón tay nhiều khi chích máu, ống máu để lâu không đậy nút,...
- Dụng cụ không đủ tiêu chuẩn: bẩn, ướt, ...
- Gắn lamen không khít.
- Pha loãng không chuẩn: hút máu không đúng vạch qui định trên potain, dung dịch pha loãng thiếu hoặc thừa.
- Dung dịch pha loãng nhiều cặn hoặc vẩn đục.
- Không trộn đều.
- Nhỏ trên buồng đếm không đúng kỹ thuật: có bọt khí, hồng cầu phân bố không đều,...
- Đếm hoặc tính kết quả sai.
