02-01-2013, 11:29 AM
Nghiệm pháp Coombs.
1. Giới thiệu chung
Nghiệm pháp Coombs là một thử nghiệm miễn dịch huyết học có vai trò quan trọng trong việc phát hiện các kháng thể không hoàn toàn có khả năng kết hợp với kháng nguyên tương ứng trên bề mặt hồng cầu nhưng không có khả năng gây ngưng kết hồng cầu.
2. Nguyên tắc của nghiệm pháp Coombs
Nếu huyết thanh chứa các kháng thể không hoàn toàn được tiếp xúc với hồng cầu đã có sẵn kháng nguyên bám trên bề mặt thì sẽ xảy ra hiện tượng kết hợp kháng nguyên – kháng thể.
Có 2 phương pháp được ứng dụng để phát hiện kháng thể không hoàn toàn:
- Coombs trực tiếp: phát hiện kháng thể đã được cảm nhiễm trên bề mặt hồng cầu (tức là kháng thể đã được gắn lên bề mặt hồng cầu)
- Coombs gián tiếp: phát hiện kháng thể không hoàn toàn lưu hành trong huyết thanh bệnh nhân.
3. Kỹ thuật thực hiện nghiệm pháp Coombs trên ống nghiệm
3.1. Nghiệm pháp Coombs trực tiếp
3.1.1. Chuẩn bị
- Bệnh phẩm: bệnh phẩm máu đã được chống đông bằng EDTA, cùng giấy chỉ định làm nghiệm pháp Coombs trực tiếp.
- Dụng cụ, trang thiết bị: kính hiển vi, máy ly tâm có số vòng và thời gian chính xác, ống nghiệm sạch, pipet, khay đựng bệnh phẩm, giá cắm pipet, cốc mỏ…
- Sinh phẩm, hóa chất: huyết thanh Coombs, NaCl 0,9%, Hồng cầu chứng.
3.1.2. Tiến hành kỹ thuật:
- Ghi thông tin cần thiết của bệnh nhân lên ống nghiệm tiến hành Coombs trực tiếp.
- Rửa sạch hồng cầu bệnh nhân (đến khi soi trên KHV thấy hồng cầu rời rạc)
- Pha hồng cầu bệnh nhân 5%
- Nhỏ vào ống nghiệm đã chuẩn bị 1 giọt hồng cầu bệnh nhân 5% và 2 giọt huyết thanh Coombs → Lắc trộn nhẹ nhàng.
- Ly tâm chéo ở 1000 vòng/ 15 – 20 giây.
- Đọc kết quả bằng mắt thường và kính hiển vi.
+ Nếu kết quả (+) → tiến hành kiểm tra lại kỹ thuật hoặc trả kết quả Coombs (+)
+ Nếu kết quả (-) → nhỏ thêm 1 giọt hồng cầu chứng và ly tâm chéo. Nếu sau ly tâm chéo (+) từ 2+ → 3+ chứng tỏ Coombs trực tiếp (-). Nếu kết quả ly tâm chéo (-) thì phải tiến hành kiểm tra lại chất lượng của kỹ thuật và các dụng cụ, sinh phẩm hóa chất.
3.2. Nghiệm pháp Coombs gián tiếp.
3.2.1. Chuẩn bị
- Bệnh phẩm: bệnh phẩm máu được lấy vào ống không có chất chống đông để tách lấy huyết thanh.
- Dụng cụ, trang thiết bị: kính hiển vi, máy ly tâm có số vòng và thời gian chính xác, ống nghiệm sạch, pipet, khay đựng bệnh phẩm, giá cắm pipet, cốc mỏ…
- Sinh phẩm, hóa chất: huyết thanh Coombs, NaCl 0,9%, hồng cầu cảm nhiễm, hồng cầu chứng, dung dịch Liss.
3.2.2. Tiến hành kỹ thuật
- Ghi thông tin cần thiết của bệnh nhân lên ống nghiệm thực hiện nghiệm pháp Coombs gián tiếp.
- Rửa hồng cầu cảm nhiễm O+ 3 lần bằng NaCl 0,9%.
- Pha hồng cầu cảm nhiễm O+ 5% bằng NaCl.
- Cho vào ống nghiệm đã chuẩn bị 1 giọt hồng cầu cảm nhiễm O+ và 2 giọt huyết thanh Coombs.
- Bịt paraphin, ủ trong bình cách thủy 30 phút hoặc ủ trong 15 phút nếu nhỏ thêm dung dich Liss.
- Sau đó tiến hành rửa 3 lần bằng NaCl.
- Nhỏ thêm 2 giọt huyết thanh Coombs → Lắc trộn nhẹ nhàng
- Ly tâm chéo ở điều kiện 1000 vòng / 15 – 20 giây.
- Đọc kết quả bằng mắt thường và kính hiển vi.
+ Nếu kết quả (+) → tiến hành kiểm tra lại kỹ thuật hoặc trả kết quả Coombs gián tiếp (+)
+ Nếu kết quả (-) → nhỏ thêm 1 giọt hồng cầu chứng và ly tâm chéo. Nếu sau ly tâm chéo (+) từ 2+ → 3+ chứng tỏ Coombs gián tiếp (-). Nếu kết quả ly tâm chéo (-) thì phải tiến hành kiểm tra lại chất lượng của kỹ thuật và các dụng cụ, sinh phẩm hóa chất.
4. Một số khó khăn thực hiện nghiệm pháp Coombs
4.1. Một số nguyên tắc
- Mẫu bệnh phẩm phải được ly tâm tách huyết thanh ngay.
- Thử nghiệm cần phải được làm trong vòng 2 giờ.
- Mẫu bệnh phẩm trước khi tiến hành xét nghiệm phải được để ở 37°C.
4.2. Một số khó khăn trong quá trình thực hiện
- Tăng protein: bệnh nhân bị tăng protein tiềm tang hoặc trong huyết thanh một paraprotein (trong bệnh đa u tủy xương hoặc Wandestrom)
- Hiện tượng đa ngưng kết:
+ Trong huyết thanh Coombs có ngưng kết tố đa giá
+ Sự gắn invivo của kháng thể đa giá ( có hoawcjkhoong có vai trò của bổ thể) có các immunoglobulin trong huyết thanh Coombs.
- Sự bất thương của màng tế bào: không hấp phụ theo cơ chế miễn dịch các protein huyết thanh.
- Hiệu lực của tế bào sợi võng
- Các khó khăn để tinh khiết với Coombs bổ thể
- Sự có mặt của 2 quần thể hồng cầu.
- Thử nghiệm Coombs trực tiếp với tẻ dưới 3 tháng tuổi: do ở đây có sự có mặt của kháng thể của mẹ lưu hành trong huyết thanh con, có thể là kháng thể đồng loài chống D, c, Fya, K, Jka.
1. Giới thiệu chung
Nghiệm pháp Coombs là một thử nghiệm miễn dịch huyết học có vai trò quan trọng trong việc phát hiện các kháng thể không hoàn toàn có khả năng kết hợp với kháng nguyên tương ứng trên bề mặt hồng cầu nhưng không có khả năng gây ngưng kết hồng cầu.
2. Nguyên tắc của nghiệm pháp Coombs
Nếu huyết thanh chứa các kháng thể không hoàn toàn được tiếp xúc với hồng cầu đã có sẵn kháng nguyên bám trên bề mặt thì sẽ xảy ra hiện tượng kết hợp kháng nguyên – kháng thể.
Có 2 phương pháp được ứng dụng để phát hiện kháng thể không hoàn toàn:
- Coombs trực tiếp: phát hiện kháng thể đã được cảm nhiễm trên bề mặt hồng cầu (tức là kháng thể đã được gắn lên bề mặt hồng cầu)
- Coombs gián tiếp: phát hiện kháng thể không hoàn toàn lưu hành trong huyết thanh bệnh nhân.
3. Kỹ thuật thực hiện nghiệm pháp Coombs trên ống nghiệm
3.1. Nghiệm pháp Coombs trực tiếp
3.1.1. Chuẩn bị
- Bệnh phẩm: bệnh phẩm máu đã được chống đông bằng EDTA, cùng giấy chỉ định làm nghiệm pháp Coombs trực tiếp.
- Dụng cụ, trang thiết bị: kính hiển vi, máy ly tâm có số vòng và thời gian chính xác, ống nghiệm sạch, pipet, khay đựng bệnh phẩm, giá cắm pipet, cốc mỏ…
- Sinh phẩm, hóa chất: huyết thanh Coombs, NaCl 0,9%, Hồng cầu chứng.
3.1.2. Tiến hành kỹ thuật:
- Ghi thông tin cần thiết của bệnh nhân lên ống nghiệm tiến hành Coombs trực tiếp.
- Rửa sạch hồng cầu bệnh nhân (đến khi soi trên KHV thấy hồng cầu rời rạc)
- Pha hồng cầu bệnh nhân 5%
- Nhỏ vào ống nghiệm đã chuẩn bị 1 giọt hồng cầu bệnh nhân 5% và 2 giọt huyết thanh Coombs → Lắc trộn nhẹ nhàng.
- Ly tâm chéo ở 1000 vòng/ 15 – 20 giây.
- Đọc kết quả bằng mắt thường và kính hiển vi.
+ Nếu kết quả (+) → tiến hành kiểm tra lại kỹ thuật hoặc trả kết quả Coombs (+)
+ Nếu kết quả (-) → nhỏ thêm 1 giọt hồng cầu chứng và ly tâm chéo. Nếu sau ly tâm chéo (+) từ 2+ → 3+ chứng tỏ Coombs trực tiếp (-). Nếu kết quả ly tâm chéo (-) thì phải tiến hành kiểm tra lại chất lượng của kỹ thuật và các dụng cụ, sinh phẩm hóa chất.
3.2. Nghiệm pháp Coombs gián tiếp.
3.2.1. Chuẩn bị
- Bệnh phẩm: bệnh phẩm máu được lấy vào ống không có chất chống đông để tách lấy huyết thanh.
- Dụng cụ, trang thiết bị: kính hiển vi, máy ly tâm có số vòng và thời gian chính xác, ống nghiệm sạch, pipet, khay đựng bệnh phẩm, giá cắm pipet, cốc mỏ…
- Sinh phẩm, hóa chất: huyết thanh Coombs, NaCl 0,9%, hồng cầu cảm nhiễm, hồng cầu chứng, dung dịch Liss.
3.2.2. Tiến hành kỹ thuật
- Ghi thông tin cần thiết của bệnh nhân lên ống nghiệm thực hiện nghiệm pháp Coombs gián tiếp.
- Rửa hồng cầu cảm nhiễm O+ 3 lần bằng NaCl 0,9%.
- Pha hồng cầu cảm nhiễm O+ 5% bằng NaCl.
- Cho vào ống nghiệm đã chuẩn bị 1 giọt hồng cầu cảm nhiễm O+ và 2 giọt huyết thanh Coombs.
- Bịt paraphin, ủ trong bình cách thủy 30 phút hoặc ủ trong 15 phút nếu nhỏ thêm dung dich Liss.
- Sau đó tiến hành rửa 3 lần bằng NaCl.
- Nhỏ thêm 2 giọt huyết thanh Coombs → Lắc trộn nhẹ nhàng
- Ly tâm chéo ở điều kiện 1000 vòng / 15 – 20 giây.
- Đọc kết quả bằng mắt thường và kính hiển vi.
+ Nếu kết quả (+) → tiến hành kiểm tra lại kỹ thuật hoặc trả kết quả Coombs gián tiếp (+)
+ Nếu kết quả (-) → nhỏ thêm 1 giọt hồng cầu chứng và ly tâm chéo. Nếu sau ly tâm chéo (+) từ 2+ → 3+ chứng tỏ Coombs gián tiếp (-). Nếu kết quả ly tâm chéo (-) thì phải tiến hành kiểm tra lại chất lượng của kỹ thuật và các dụng cụ, sinh phẩm hóa chất.
4. Một số khó khăn thực hiện nghiệm pháp Coombs
4.1. Một số nguyên tắc
- Mẫu bệnh phẩm phải được ly tâm tách huyết thanh ngay.
- Thử nghiệm cần phải được làm trong vòng 2 giờ.
- Mẫu bệnh phẩm trước khi tiến hành xét nghiệm phải được để ở 37°C.
4.2. Một số khó khăn trong quá trình thực hiện
- Tăng protein: bệnh nhân bị tăng protein tiềm tang hoặc trong huyết thanh một paraprotein (trong bệnh đa u tủy xương hoặc Wandestrom)
- Hiện tượng đa ngưng kết:
+ Trong huyết thanh Coombs có ngưng kết tố đa giá
+ Sự gắn invivo của kháng thể đa giá ( có hoawcjkhoong có vai trò của bổ thể) có các immunoglobulin trong huyết thanh Coombs.
- Sự bất thương của màng tế bào: không hấp phụ theo cơ chế miễn dịch các protein huyết thanh.
- Hiệu lực của tế bào sợi võng
- Các khó khăn để tinh khiết với Coombs bổ thể
- Sự có mặt của 2 quần thể hồng cầu.
- Thử nghiệm Coombs trực tiếp với tẻ dưới 3 tháng tuổi: do ở đây có sự có mặt của kháng thể của mẹ lưu hành trong huyết thanh con, có thể là kháng thể đồng loài chống D, c, Fya, K, Jka.
