02-01-2013, 05:29 PM
1. Chẩn đoán trực tiếp
1.1. Lấy bệnh phẩm
Bệnh phẩm là những chất có chứa vi khuẩn gây bệnh lấy từ người bệnh. Vì vậy bệnh phẩm được lấy tuỳ theo từng bệnh. Bệnh phẩm có thể là phân (trong các nhiễm khuẩn đường ruột), có thể là máu (trong nhiễm trùng máu), các chất dịch (dịch não tuỷ, dịch màng bụng, dịch màng phổi), hoặc các chất dịch ở các hốc tự nhiên (dịch ngoáy họng, dịch âm đạo). Để lấy bệnh phẩm đúng kỹ thuật, phải đảm bảo 3 nguyên tắc:
- Đúng vị trí: Lấy ở nơi đang có biểu hiện bệnh lý, trong các viêm nhiễm thì nên lấy ở ranh giới giữa nơi lành và nơi tổn thương.
- Đúng thời gian: Lấy đúng lúc bệnh phẩm có nhiều vi khuẩn hoặc khi cha dùng kháng sinh. Ví dụ: lấy máu cấy tìm vi khuẩn thương hàn phải lấy từ tuần đầu của bệnh.
- Phải vô khuẩn: Không để vi khuẩn từ bên ngoài nhiễm vào bệnh phẩm làm sai kết quả và không gây nhiễm khuẩn thêm cho bệnh nhân.
Sau khi bệnh phẩm lấy xong cho vào các dụng cụ vô khuẩn dán nhãn đề tên ngưòi bệnh, khoa, phòng điều trị, tên chất thử, thời gian lấy bệnh phẩm...đóng gói đúng quy cách rồi gửi về phòng xét nghiệm. Đa số bệnh phẩm cần được nuôi cấy nên phải giữ cho vi khuẩn còn sống đến lúc làm xét nghiệm. Muốn vậy thì bệnh phẩm phải được chuyển và làm xét nghiệm ngay. Nếu chưa có điều kiện phải giữ bệnh phẩm trong môi trường hoặc dung dịch bảo quản ở nhiệt độ thích hợp.
1.2. Nhuộm soi (chẩn đoán nhanh)
Tùy theo từng chẩn đoán bệnh mà chọn phương pháp nhuộm soi thích hợp. Đa số vi khuẩn nhuộm bằng phương pháp gram, một số nhuộm bằng phương pháp đặc biệt như Ziehl neelsen, Albert, thấm bạc, Wayson… Nhuộm bệnh phẩm để quan sát hình thể, kích thước, cách sắp xếp và tính chất bắt màu của vi khuẩn. Đánh giá các loại tế bào và mối quan hệ giữa vi khuẩn và tế bào như vi khuẩn nằm trong hay ngoài tế bào.
Kết quả nhuộm soi thường chỉ có giá trị chẩn đoán sơ bộ và định hướng cho nuôi cấy. Đây là phương pháp đơn giản, nhanh, ít tốn kém và có thể thực hiện được ở các tuyến y tế cơ sở. Đối với một số bệnh cấp tính và có thể thành dịch thì chẩn đoán nhanh có vai trò quan trọng trong phòng bệnh và điều trị tuy rằng chưa được chính xác, ví dụ bệnh bạch hầu, dịch hạch. Tuy nhiên, trong một số trường hợp nhuộm soi gần như có ý nghĩa quyết định cho chẩn đoán. Ví dụ : bệnh lậu, giang mai, lao.
1.3. Nuôi cấy
Nuôi cấy vi khuẩn trên các môi trờng thích hợp nhằm tăng sinh vi khuẩn về số lượng và tách được những khuẩn lạc riêng để nhận dạng khuẩn lạc và các tính chất của nó. Để nuôi cấy bệnh phẩm, ngời ta dùng môi trường phân lập. Hầu hết các trường hợp, môi trường phân lập là môi trường đặc. Môi trường này ngoài chất dinh dưỡng còn có một số chất khác có tác dụng ức chế hoặc kích thích chọn lọc các vi khuẩn cần tìm phát triển. Dựa vào tính chất của khuẩn lạc như hình dạng, kích thước, màu sắc hoặc tính chất nuôi cấy như tan máu, lên men một số đường...mà nhận biết và tách biệt được vi khuẩn cần tìm thành dòng vi khuẩn mới. Khi cấy chuyển vùng cần lưu ý:
- Vùng nguyên thuỷ không nên cấy quá ít vì như vậy sẽ làm giảm tỉ lệ dương tính khi bệnh phẩm có ít vi khuẩn.
- Các vùng tiếp theo các đường cấy nên thưa dần nhưng chỉ nên để vài đường cấy đầu tiên của vùng sau chạm vào vùng trước, như vậy sẽ có được những khuẩn lạc riêng rẽ.
1.4. Xác định vi khuẩn.
1.4.1. Xác định tính chất sinh vật hoá học và định typ sinh học (Biotype):
Mỗi vi khuẩn có khả năng chuyển hoá các cơ chất bằng hệ thống enzym khác nhau. Sau khi nuôi cấy trên các môi trường phân lập, dựa vào tính chất sinh vật hoá học của mỗi loại vi khuẩn mà tiếp tục cấy chuyển các vi khuẩn đó sang các môi trường sinh vật hoá học thích hợp. Môi trường xác định tính chất sinh vật hoá học có những hoá chất đặc biệt để xác định khả năng chuyển hóa, sinh enzym, tạo sản phẩm chuyển hoá của vi khuẩn. Chú ý không được lấy khuẩn lạc từ môi trường phân lập có chất ức chế để xác định tính chất sinh vật hoá học vì những vi khuẩn khác có thể ở cạnh hoặc ở dưới khuẩn lạc. Có một số vi khuẩn có thể phân typ theo tính chất sinh vật hoá học.
1.4.2. Xác định tính chất kháng nguyên (định typ huyết thanh - serotype):
Dùng kháng thể đã biết trước (kháng huyết thanh mẫu) để xác định kháng nguyên (kháng nguyên lông, kháng nguyên thân, kháng nguyên vỏ...) của vi khuẩn phân lập được dựa vào phản ứng kết hợp kháng nguyên và kháng thể đặc hiệu. Vì vậy xác định vi khuẩn bằng cách này có độ chính xác cao. Phương pháp này thường được áp dụng trong việc xác định vi khuẩn đường ruột bằng các phản ứng ngưng kết. Các phản ứng này xác định nhóm, typ của vi khuẩn dựa vào kháng huyết thanh.
1.4.3. Xác định tính chất ly giải bởi phage (định typ ly giải- lysotype):
Dùng phage đã biết trước cho tiếp xúc với vi khuẩn nghi ngờ xác định vi khuẩn có bị ly giải bởi phage hay không. Phương pháp này có độ chính xác rất cao, áp dụng trong chẩn đoán dịch tễ song khó có chủng phage mẫu.
1.4.4. Chẩn đoán khả năng gây bệnh thực nghiệm:
Một số vi sinh vật gây bệnh cho người đồng thời cũng có khả năng gây bệnh cho súc vật nên có thể tiêm truyền cho súc vật để gây bệnh thực nghiệm. Các súc vật thường đợc tiêm truyền là thỏ, chuột lang, chuột bạch, chuột nhắt trắng. Đối với một số vi sinh vật có thể cần các súc vật lớn như dê, cừu, khỉ, bò… Đường tiêm truyền có thể tiêm trong da, dưới da, bắp, tĩnh mạch, phúc mạc, giác mạc… tuỳ theo khả năng gây bệnh của từng loại vi khuẩn. Các loại vi sinh vật khác nhau thì gây nên những bệnh cảnh khác nhau và có tính chất đặc trưng cho các loại súc vật nhất định. Sau khi tiêm truyền, theo dõi sự diễn biến của bệnh và tìm những tổn thương điển hình. Cuối cùng có thể mổ súc vật để đánh giá khả năng gây bệnh của vi khuẩn bằng đại thể.
Ngoài bốn phương pháp trên, ngày nay nhờ sự tiến bộ của khoa học người ta đã có nhiều phương pháp chẩn đoán nhanh được bệnh nhiễm khuẩn với độ chính xác cao. Ví dụ: kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp phát hiện vi khuẩn tả; phản ứng ELISA tìm kháng nguyên, kỹ thuật khuếch đại gen PCR…
2. Chẩn đoán gián tiếp (Chẩn đoán huyết thanh)
2.1. Nguyên tắc
Chẩn đoán gián tiếp các bệnh nhiễm khuẩn là dựa vào kháng nguyên mẫu đã biết trước để phát hiện kháng thể bằng các phản ứng kết hợp kháng nguyên và kháng thể đặc hiệu. Thông qua kết quả của phản ứng mà kết luận sự có mặt của kháng thể trong huyết thanh bệnh nhân.
2.2. Các bước tiến hành
2.2.1. Lấy bệnh phẩm:
Lấy máu tĩnh mạch, tuỳ theo từng phương pháp mà lấy số lượng máu thích hợp, thường lấy 3ml máu cho vào ống nghiệm khô, để máu đông, ly tâm lấy huyết thanh, phá huỷ bổ thể ở 560C/ 30phút. Nên lấy máu hai lần: lần thứ nhất vào những ngày đầu của bệnh, lần thứ hai sau lần thứ nhất 7-10 ngày để xác định động lực kháng thể.
2.2.2. Làm phản ứng huyết thanh:
- Huyết thanh bệnh nhân được pha loãng thành nhiều nồng độ khác nhau, thường giảm dần theo bậc 2.
- Hai mẫu huyết thanh I và II cùng được tiến hành làm phản ứng trong cùng một điều kiện (huyết thanh kép).
- Xác định hiệu giá kháng thể: Hiệu giá kháng thể được tính là nồng độ huyết thanh được pha loãng nhất mà ở đó phản ứng kết hợp kháng nguyên và kháng thể còn xẩy ra (+).
- Xác định động lực kháng thể: So sánh hiệu giá kháng thể của hai mẫu huyết thanh lần I và II để tìm động lực kháng thể. Động lực kháng thể là sự gia tăng hiệu giá kháng thể lần II so với lần I, ít nhất là gấp 2 lần. Khi có động lực kháng thể thì kết luận người bệnh bị nhiễm khuẩn.
Ngày nay có nhiều test nhanh để chẩn đoán huyết thanh do các hãng cung cấp để phát hiện kháng thể nhng cũng có thể tìm kháng nguyên vi sinh vật. Ví dụ như chẩn đoán HIV, viêm gan virus.
1.1. Lấy bệnh phẩm
Bệnh phẩm là những chất có chứa vi khuẩn gây bệnh lấy từ người bệnh. Vì vậy bệnh phẩm được lấy tuỳ theo từng bệnh. Bệnh phẩm có thể là phân (trong các nhiễm khuẩn đường ruột), có thể là máu (trong nhiễm trùng máu), các chất dịch (dịch não tuỷ, dịch màng bụng, dịch màng phổi), hoặc các chất dịch ở các hốc tự nhiên (dịch ngoáy họng, dịch âm đạo). Để lấy bệnh phẩm đúng kỹ thuật, phải đảm bảo 3 nguyên tắc:
- Đúng vị trí: Lấy ở nơi đang có biểu hiện bệnh lý, trong các viêm nhiễm thì nên lấy ở ranh giới giữa nơi lành và nơi tổn thương.
- Đúng thời gian: Lấy đúng lúc bệnh phẩm có nhiều vi khuẩn hoặc khi cha dùng kháng sinh. Ví dụ: lấy máu cấy tìm vi khuẩn thương hàn phải lấy từ tuần đầu của bệnh.
- Phải vô khuẩn: Không để vi khuẩn từ bên ngoài nhiễm vào bệnh phẩm làm sai kết quả và không gây nhiễm khuẩn thêm cho bệnh nhân.
Sau khi bệnh phẩm lấy xong cho vào các dụng cụ vô khuẩn dán nhãn đề tên ngưòi bệnh, khoa, phòng điều trị, tên chất thử, thời gian lấy bệnh phẩm...đóng gói đúng quy cách rồi gửi về phòng xét nghiệm. Đa số bệnh phẩm cần được nuôi cấy nên phải giữ cho vi khuẩn còn sống đến lúc làm xét nghiệm. Muốn vậy thì bệnh phẩm phải được chuyển và làm xét nghiệm ngay. Nếu chưa có điều kiện phải giữ bệnh phẩm trong môi trường hoặc dung dịch bảo quản ở nhiệt độ thích hợp.
1.2. Nhuộm soi (chẩn đoán nhanh)
Tùy theo từng chẩn đoán bệnh mà chọn phương pháp nhuộm soi thích hợp. Đa số vi khuẩn nhuộm bằng phương pháp gram, một số nhuộm bằng phương pháp đặc biệt như Ziehl neelsen, Albert, thấm bạc, Wayson… Nhuộm bệnh phẩm để quan sát hình thể, kích thước, cách sắp xếp và tính chất bắt màu của vi khuẩn. Đánh giá các loại tế bào và mối quan hệ giữa vi khuẩn và tế bào như vi khuẩn nằm trong hay ngoài tế bào.
Kết quả nhuộm soi thường chỉ có giá trị chẩn đoán sơ bộ và định hướng cho nuôi cấy. Đây là phương pháp đơn giản, nhanh, ít tốn kém và có thể thực hiện được ở các tuyến y tế cơ sở. Đối với một số bệnh cấp tính và có thể thành dịch thì chẩn đoán nhanh có vai trò quan trọng trong phòng bệnh và điều trị tuy rằng chưa được chính xác, ví dụ bệnh bạch hầu, dịch hạch. Tuy nhiên, trong một số trường hợp nhuộm soi gần như có ý nghĩa quyết định cho chẩn đoán. Ví dụ : bệnh lậu, giang mai, lao.
1.3. Nuôi cấy
Nuôi cấy vi khuẩn trên các môi trờng thích hợp nhằm tăng sinh vi khuẩn về số lượng và tách được những khuẩn lạc riêng để nhận dạng khuẩn lạc và các tính chất của nó. Để nuôi cấy bệnh phẩm, ngời ta dùng môi trường phân lập. Hầu hết các trường hợp, môi trường phân lập là môi trường đặc. Môi trường này ngoài chất dinh dưỡng còn có một số chất khác có tác dụng ức chế hoặc kích thích chọn lọc các vi khuẩn cần tìm phát triển. Dựa vào tính chất của khuẩn lạc như hình dạng, kích thước, màu sắc hoặc tính chất nuôi cấy như tan máu, lên men một số đường...mà nhận biết và tách biệt được vi khuẩn cần tìm thành dòng vi khuẩn mới. Khi cấy chuyển vùng cần lưu ý:
- Vùng nguyên thuỷ không nên cấy quá ít vì như vậy sẽ làm giảm tỉ lệ dương tính khi bệnh phẩm có ít vi khuẩn.
- Các vùng tiếp theo các đường cấy nên thưa dần nhưng chỉ nên để vài đường cấy đầu tiên của vùng sau chạm vào vùng trước, như vậy sẽ có được những khuẩn lạc riêng rẽ.
1.4. Xác định vi khuẩn.
1.4.1. Xác định tính chất sinh vật hoá học và định typ sinh học (Biotype):
Mỗi vi khuẩn có khả năng chuyển hoá các cơ chất bằng hệ thống enzym khác nhau. Sau khi nuôi cấy trên các môi trường phân lập, dựa vào tính chất sinh vật hoá học của mỗi loại vi khuẩn mà tiếp tục cấy chuyển các vi khuẩn đó sang các môi trường sinh vật hoá học thích hợp. Môi trường xác định tính chất sinh vật hoá học có những hoá chất đặc biệt để xác định khả năng chuyển hóa, sinh enzym, tạo sản phẩm chuyển hoá của vi khuẩn. Chú ý không được lấy khuẩn lạc từ môi trường phân lập có chất ức chế để xác định tính chất sinh vật hoá học vì những vi khuẩn khác có thể ở cạnh hoặc ở dưới khuẩn lạc. Có một số vi khuẩn có thể phân typ theo tính chất sinh vật hoá học.
1.4.2. Xác định tính chất kháng nguyên (định typ huyết thanh - serotype):
Dùng kháng thể đã biết trước (kháng huyết thanh mẫu) để xác định kháng nguyên (kháng nguyên lông, kháng nguyên thân, kháng nguyên vỏ...) của vi khuẩn phân lập được dựa vào phản ứng kết hợp kháng nguyên và kháng thể đặc hiệu. Vì vậy xác định vi khuẩn bằng cách này có độ chính xác cao. Phương pháp này thường được áp dụng trong việc xác định vi khuẩn đường ruột bằng các phản ứng ngưng kết. Các phản ứng này xác định nhóm, typ của vi khuẩn dựa vào kháng huyết thanh.
1.4.3. Xác định tính chất ly giải bởi phage (định typ ly giải- lysotype):
Dùng phage đã biết trước cho tiếp xúc với vi khuẩn nghi ngờ xác định vi khuẩn có bị ly giải bởi phage hay không. Phương pháp này có độ chính xác rất cao, áp dụng trong chẩn đoán dịch tễ song khó có chủng phage mẫu.
1.4.4. Chẩn đoán khả năng gây bệnh thực nghiệm:
Một số vi sinh vật gây bệnh cho người đồng thời cũng có khả năng gây bệnh cho súc vật nên có thể tiêm truyền cho súc vật để gây bệnh thực nghiệm. Các súc vật thường đợc tiêm truyền là thỏ, chuột lang, chuột bạch, chuột nhắt trắng. Đối với một số vi sinh vật có thể cần các súc vật lớn như dê, cừu, khỉ, bò… Đường tiêm truyền có thể tiêm trong da, dưới da, bắp, tĩnh mạch, phúc mạc, giác mạc… tuỳ theo khả năng gây bệnh của từng loại vi khuẩn. Các loại vi sinh vật khác nhau thì gây nên những bệnh cảnh khác nhau và có tính chất đặc trưng cho các loại súc vật nhất định. Sau khi tiêm truyền, theo dõi sự diễn biến của bệnh và tìm những tổn thương điển hình. Cuối cùng có thể mổ súc vật để đánh giá khả năng gây bệnh của vi khuẩn bằng đại thể.
Ngoài bốn phương pháp trên, ngày nay nhờ sự tiến bộ của khoa học người ta đã có nhiều phương pháp chẩn đoán nhanh được bệnh nhiễm khuẩn với độ chính xác cao. Ví dụ: kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp phát hiện vi khuẩn tả; phản ứng ELISA tìm kháng nguyên, kỹ thuật khuếch đại gen PCR…
2. Chẩn đoán gián tiếp (Chẩn đoán huyết thanh)
2.1. Nguyên tắc
Chẩn đoán gián tiếp các bệnh nhiễm khuẩn là dựa vào kháng nguyên mẫu đã biết trước để phát hiện kháng thể bằng các phản ứng kết hợp kháng nguyên và kháng thể đặc hiệu. Thông qua kết quả của phản ứng mà kết luận sự có mặt của kháng thể trong huyết thanh bệnh nhân.
2.2. Các bước tiến hành
2.2.1. Lấy bệnh phẩm:
Lấy máu tĩnh mạch, tuỳ theo từng phương pháp mà lấy số lượng máu thích hợp, thường lấy 3ml máu cho vào ống nghiệm khô, để máu đông, ly tâm lấy huyết thanh, phá huỷ bổ thể ở 560C/ 30phút. Nên lấy máu hai lần: lần thứ nhất vào những ngày đầu của bệnh, lần thứ hai sau lần thứ nhất 7-10 ngày để xác định động lực kháng thể.
2.2.2. Làm phản ứng huyết thanh:
- Huyết thanh bệnh nhân được pha loãng thành nhiều nồng độ khác nhau, thường giảm dần theo bậc 2.
- Hai mẫu huyết thanh I và II cùng được tiến hành làm phản ứng trong cùng một điều kiện (huyết thanh kép).
- Xác định hiệu giá kháng thể: Hiệu giá kháng thể được tính là nồng độ huyết thanh được pha loãng nhất mà ở đó phản ứng kết hợp kháng nguyên và kháng thể còn xẩy ra (+).
- Xác định động lực kháng thể: So sánh hiệu giá kháng thể của hai mẫu huyết thanh lần I và II để tìm động lực kháng thể. Động lực kháng thể là sự gia tăng hiệu giá kháng thể lần II so với lần I, ít nhất là gấp 2 lần. Khi có động lực kháng thể thì kết luận người bệnh bị nhiễm khuẩn.
Ngày nay có nhiều test nhanh để chẩn đoán huyết thanh do các hãng cung cấp để phát hiện kháng thể nhng cũng có thể tìm kháng nguyên vi sinh vật. Ví dụ như chẩn đoán HIV, viêm gan virus.
