03-23-2012, 11:22 AM
NHUỘM GRAM
Nhuộm Gram là một phương pháp thực nghiệm nhằm phân biệt các loài vi khuẩn thành 2 nhóm Gram dương (Gram positive) và Gram âm (Gram negative) dựa trên các đặc tính hoá lý của thành tế bào. Phương pháp này được đặt tên theo người phát minh ra nó, nhà khoa học người Đan Mạch Hans Christian Gram (1853 -1938). Ông phát triển kỹ thuật này vào năm 1884, về sau được Hucker và nhiều người khác cải tiến.
I . MỤC TIÊU
1. Nắm đươc nguyên lý của kỹ thật nhuộm Gram
2. Thực hiện được kỹ thuật nhuộm Gram
3. Nhận định được kết quả nhuộm Gram
4. Tránh được các yếu tố kỹ thuật làm sai lệch kết quả nhuộm Gram
II. NỘI DUNG
1. Nguyên lý
Dựa trên sự khác nhau về cấu trúc của vách tế bào nên trong quá trình nhuộm Gram, vi khuẩn Gram dương sẽ giữ được phức hợp tím gentians-iod không bị tẩy màu bởi alcohol, trong khi vi khuẩn Gram âm không giữ được phức hợp này. Do vậy, kết quả sau khi nhuộm là vi khuẩn Gram dương vẫn giữ được màu tím của gentians, còn vi khuẩn Gram âm bắt màu hồng của fucshin.
2. Dụng cụ, thiết bị
Kính hiển vi, que cấy đầu tròn, đèn cồn, diêm, phiến kính (slide), chậu rửa, bình xịt nước cất và các dụng cụ cần thiết.
3. Vật liệu, hoá chất
(1) Các loài vi khuẩn hoặc các hỗn dịch các vi khuẩn này. Vi khuẩn Gram âm: E.coli, Salmonella,..; Gram dương: S. aureus, Bacillus cereus; dịch cơ thể hoặc mẫu sinh thiết bị nghi ngờ nhiễm khuẩn.
(2) Dung dịch tím gentians
(3) Dung dịch Lugol
(4) Dung dịch alcohol 90%
(5) Dung dịch fucshin kiềm
Pha thuốc nhuộm tím gentians: + Tím gentians nồng độ 1/10 trong cồn ethylic 95[sup]0[/sup] 10ml + Acid phenic 1ml + Nước cất 100ml Lắc đều, lọc qua giấy lọc. Pha dung dịch lugol: + Iod 1g + Kali iodid (KI) 2g + Nước cất 5ml Nghiền tan trong cối sứ rồi cho thêm nước cất cho đủ 200ml Pha thuốc nhuộm Fucshin kiềm: + Fucshin kiềm nồng độ 1/10 trong cồn ethylic 95[sup]0[/sup] 10ml + Acid phenic 5ml + Nước cất 100ml Lắc đều, lọc qua giấy lọc. 4. Các bước tiến hành
Bước một, dàn tiêu bản và cố định tiêu bản:
Dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ ống giống thạch nghiêng (hoặc dịch cơ thể, mẫu sinh thiết bị nghi ngờ nhiễm khuẩn) hoà vào 1 giọt nước muối sinh lý ở giữa phiến kính, để khô trong phòng thí nghiệm.
Cố định tiêu bản bằng cách hơ nhanh trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần để gắn chặt vi khuẩn vào phiến kính. Việc cố định nhằm 3 mục đích: giết chết vi khuẩn, gắn chặt vi khuẩn vào phiến kính và làm vết bôi bắt màu tốt hơn vì các tế bào chết bắt màu tốt hơn các tế bào sống.
Bước hai, nhuộm màu:
- Thứ nhất, nhuộm bằng dung dịch tím gentians trong 30 giây đến 1 phút, rửa nước;
- Thứ hai, nhuộm thêm dung dịch lugol và giữ trong 1 phút, rửa nước;
- Thứ ba, khử màu: nhỏ dung dịch alcohol 90%, giữ khoảng 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước;
- Thứ tư, nhuộm tiếp bằng dung dịch Fucshin trong 1 phút, rửa nước, để khô.
* Kết quả: quan sát ở vật kính dầu 100x. Nếu nhuộm đúng vi khuẩn Gram dương bắt màu tím, Gram âm bắt màu hồng.
5. Giải thích tính bắt màu Gram của vi khuẩn
Vi khuẩn Gram dương có vách tế bào dày từ 15 đến 50 nm, dạng lưới, cấu tạo bởi peptidoglycan. Chất này có khả năng giữ phức hợp tím gentians - iod. Trong khi đó, lớp vách tế bào peptidoglycan của các vi khuẩn Gram âm thì mỏng hơn và thường có thêm lớp màng lipopolysaccharde (LPS) bên ngoài.
![[Image: gram002.bmp]](http://www.dhsphue.edu.vn/dhsphue/uploaded/gram002.bmp)
Sau khi nhuộm với phức hợp gentians - iod, mẫu được xử lí tiếp với hỗn hợp khử màu, làm mất nước của các lớp peptidoglycan trong vách tế bào Gram dương, từ đó làm giảm khoảng trống giữa các phân tử và khiến vách tế bào bắt giữ phức hợp gentians – iod bên trong tế bào.
Đối với vi khuẩn Gram âm, dung dịch alcohol 90% đóng vai trò là chất hoà tan lipit và làm tan màng ngoài của vách tế bào. Lớp peptidoglycan mỏng (chỉ khoảng 10 nm) không thể giữ lại phức hợp gentians – iod và tế bào Gram âm bị khử màu và bắt màu thuốc nhuộm bổ sung.
6. Những sai lầm có thể gặp trong phương pháp nhuộm Gram
- Có những sai lầm trong phương pháp nhuộm Gram làm cho vi khuẩn Gram dương nhuộm thành màu hồng của vi khuẩn Gram âm, đó là:
+ Phết vi khuẩn ở lứa cấy qúa già (trên 24h), cấu trúc vách vi khuẩn gram dương không còn bền chặt như ở lứa cấy trẻ, do vậy mất khả năng ngăn cản sự tẩy màu của alcohol.
+ Dung dịch lugol không còn tốt, do đã pha quá lâu và mất đi iod. Trường hợp này có thể nhận biết khi dung dịch lugol không còn sậm màu.
+ Tẩy màu bằng alcohol quá lâu đã làm cho vi khuẩn Gram dương cũng bị tẩy màu.
- Có những sai lầm trong phương pháp nhuộm Gram làm cho vi khuẩn Gram âm nhuộm thành màu tím của vi khuẩn Gram dương, đó là:
+ Phết vi khuẩn quá dầy làm cho alcohol không thể tẩy màu toàn bộ vi khuẩn trong phết nhuộm.
+ Tẩy màu bằng alcohol quá ngắn hay dung dịch alcohol bị pha quá loãng làm cho màu Gram không được tẩy khỏi tế bào vi khuẩn.
Impossible is nothing 
