Các phương pháp cơ bản trong chẩn đoán vi khuẩn gây bệnh

[tuyenlab]

1. NHỮNG KIẾN THỨC CƠ BẢN VỂ VI KHUẨN

1.1. Khái niệm vi khuẩn
Vi sinh vật (micro-organism) bao gồm vi khuẩn và virus, nhưng vi khuẩn có đầy đủ đặc điểm của một vi sinh vật như khả năng tự tổng hợp chất dinh dưỡng để phát triển và nhân lên. Trên thực tế, vi khuẩn là những đơn bào không có màng nhân, thuộc giới procaryote, có thể quan sát được bằng kính hiển vi.
1.2. Hình thể, kích thước và cấu trúc vi khuẩn
Vi khuẩn là những sinh vật đơn bào, chúng có cấu trúc và hoạt động đơn giản hơn nhiều so với các tế bào có màng nhân (eucaryote). Tuy nhiên có một vài cơ quan như vách tế bào hay chức năng di truyền và sự vận chuyển di truyền phức tạp không kém sinh vật phát triển.

1.2.1. Hình thể và kích thước vi khuẩn

Mỗi loại vi khuẩn có hình dạng và kích thước nhất định, do vách của tế bào vi khuẩn quyết định. Hình thể và kích thước của vi khuẩn có thể quan sát và xác định được bằng phương pháp nhuộm và quan sát bằng kính hiển vi. Để xác định vi khuẩn, hình thể là một tiêu chuẩn rất quan trọng đóng vai trò định hướng, để định loại một vi khuẩn còn phải kết hợp với với các yếu tố khác như tính chất sinh vật hoá học, kháng nguyên của vi khuẩn và khả năng gây bệnh). Tuy nhiên trong một số trường hợp nhất định, dựa vào hình thể vi khuẩn kết hợp với lâm sàng người ta có thể chẩn đoán xác định bệnh.

Đơn vị đo kích thước của vi khuẩn là micromet (1 µm = 1/1000 mm). Kích thước và hình thể của các loại vi khuẩn khác nhau thì không giống nhau và có thể còn phụ thuộc vào điều kiện tồn tại của chúng. Dựa vào hình thể, vi khuẩn được chia ra làm 3 loại lớn.

1.2.1.1. Các cầu khuẩn:

Cầu khuẩn là những vi khuẩn có hình cầu, nhưng cũng có thể là hình bầu dục hoặc ngọn nến, có đường kính trung bình khoảng 1 µm. Cầu khuẩn được chia thành một số loại sau:

- Song cầu (Diplococci) là những cầu khuẩn đứng thành từng đôi như phế cầu (Streptococcus pneunoniae), lậu cầu (Neisseria gonorrhoeae) và não mô cầu (Neisseria meningitidis – Meningococcus). Nếu có nhiều đôi nối đuôi nhau chúng sẽ tạo thành chuỗi.

- Liên cầu (Streptococci) là những cầu khuẩn đứng thành chuỗi.
- Tụ cầu (Staphylococci) là những cầu khuẩn đứng thành từng đám như chùm nho như tụ cầu vàng.

1.2.1.2. Trực khuẩn

Trực khuẩn là những vi khuẩn hình que, đầu tròn hay đầu vuông, kích thước thường gặp có chiều rộng khoảng 1 µm, chiều dài khoảng 2 - 5 µm (các trực khuẩn không gây bệnh thường có kích thước lớn hơn). Dựa trên đặc điểm có thể tạo nha bào và sống hiếu khí hay kị khí, có thể chia trực khuẩn ra làm 3 loại:

- Bacteria: là những trực khuẩn không sinh nha bào, phần lớn trực khuẩn gây bệnh thuộc loại này như trực khuẩn đường ruột...

- Bactilli: là những trực khuẩn hiếu khí sinh nha bào như trực khuẩn than (Bacillus anthracis).
- Clostridia: là những trực khuẩn kỵ khí sinh nha bào gây bệnh bằng ngoại độc tố như trực khuẩn uốn ván (Clostridium tetani), trực khuẩn gây bệnh ngộ độc thịt (C. Botulinum), trực khuẩn gây bệnh hoại thư (C. perfringens).

1.2.1.3. Xoắn khuẩn (Spirochaetales)

Xoắn khuẩn là những vi khuẩn có hình sợi lượn sóng và di động, có chiều dài có thể lên tới 30 µm. Có 3 giống vi khuẩn thuộc loại này gây bệnh quan trọng là Treponema (xoắn khuẩn giang mai – Treponema pallidum), Leptospira và Borelia.

Ngoài những dạng điển hình trên còn có những loại vi khuẩn có hình thể trung gian.

- Trung gian giữa cầu khuẩn và trực khuẩn là cầu - trực khuẩn, như vi khuẩn dịch hạch.
- Trung gian giữa trực khuẩn và xoắn khuẩn là phẩy khuẩn tả (Vibrio cholerae).

1.2. Cấu trúc và chức năng của tế bào vi khuẩn

1.2.1. Nhân của vi khuẩn

Vi khuẩn không có nhân điển hình vì không có màng nhân, nhưng có cơ quan chứa thông tin di truyền đó là nhiễm sắc thể (chromosome) tồn tại trong nguyên sinh chất. Bản chất nhiễm sắc thể là ADN có chiều dài khoảng 1 mm, khép kín, trọng lượng 2 tỷ dalton (2 x 10[sup]9[/sup]) chứa khoảng 3000 gen, được bao bọc bới protein kiềm. Nhiễm sắc thể có hình cầu, hình que hay hình chữ V, sao chép theo kiểu bán bảo tồn dẫn đến sự phân bào. Tuy nhiên, sự phân bào còn phụ thuộc vào sự phân chia màng sinh chất và vách tế bào.

Ngoài nhiễm sắc thể, một số vi khuẩn còn có yếu tố di truyền ngoài nhiễm sắc thể đó là các loại plasmid và transposon.

1.2.2. Chất nguyên sinh (cytoplasma)

Chất nguyên sinh của vi khuẩn chứa những thành phần hoà tan như protein, peptid, acid amin, vitamin, ARN, ribosom, các muối khoáng, một số nguyên tố hiếm và sắc tố, ngoài ra nó còn chứa các hạt vùi. Bản chất hạt vùi là những không bào chứa lipid, glycogen và một số chất có tính đặc trưng cao với một số loại vi khuẩn. Vì vậy, nó có ý nghĩa trong chẩn đoán như ở vi khuẩn bạch hầu có hạt vùi chứa polymetaphosphat.

Tuy nhiên nếu so với tế bào của vi sinh vật có nhân điển hình (eucaryote), nguyên sinh chất của vi khuẩn không có ty lạp thể, lưới nội bào và cơ quan phân bào.

1.2.3. Màng nguyên sinh (cytoplasma membrane)

Màng nguyên sinh là một lớp màng mỏng có tính đàn hồi, bao gồm 60% protein, 40% lipid chủ yếu là các phospholipid. Màng nguyên sinh thực hiện một số chức năng quan trọng quyết định sự tồn tại của tế bào vi khuẩn như:

- Là nơi hấp thụ và đào thải chọn lọc các chất qua 2 chơ chế khuyếch tán bị dộng nhờ áp lực thẩm thấu với những chất có phân tử lượng thấp và vận chuyển chủ động để thực hiện với những chất có phân tử lượng cao.

- Là nơi tổng hợp các enzym ngoại bào để phân hủy các chất có có phân tử lượng quá lớn không thể vận chuyển qua màng thành những chất có phân tử lượng thấp hơn để dễ hấp thu.

- Là nơi tổng hợp các thành phần của vách tế bào.

- Là nơi tồn tại của hệ thống enzym tế bào, thực hiện các quá trình năng lượng chủ yếu của tế bào vì không có ty lạp thể.
- Tham gia vào quá trình phân bào nhờ các mạc thể (mesosome) vì là nơi gắn các nhiễm sắc thể, mạc thể thường gặp ở vi khuẩn gram (+).

1.2.4. Vách (cell wall)
Vách tế bào có ở mọi vi khuẩn trừ Mycoplasma.

1.2.4.1. Cấu trúc của vách vi khuẩn
Vách tế bào là bộ khung vững chắc bao bên ngoài màng sinh chất, được cấu tạo bới đại phân tử glycopeptid, được tổng hợp liên tục bao gồm đường amin và acid amin. Các acid amin khác nhau tùy từng vi khuẩn. Chính vì vậy, vách của các vi khuẩn Gr(+) và Gr(-) có những đặc điểm khác nhau.

1.2.4.2. Chức năng của vách vi khuẩn

Chức năng quan trọng nhất của vách vi khuẩn là duy trì hình dạng vi khuẩn. Sự khác nhau về thành phần vách tế bào của các loại vi khuẩn khác nhau có thể là nguyên nhân của tính chất ưa các loại thuốc nhuộm khác nhau. Đối với vi khuẩn Gr (+) do vách của vi khuẩn dầy, nên phức hợp iod-gentian không thể thấm ra ngoài sau khi vi khuẩn đã bị tẩy bằng cồn, nên vi khuẩn Gr (+) vẫn giữ được mầu tím, còn vi khâẩn Gr(-) bị mất mầu này sau khi tẩy cồn.

Vách vi khuẩn quyết định tính chất kháng nguyên thân của vi khuẩn, là cơ sở để xác định và phân loại vi khuẩn.

Vách tế bào là nơi tác động của nhóm kháng sinh beta lactam, đồng thời là nơi tác động của lysozym.
Ngoài ra, vách tế bào còn là nơi tiếp nhận (receptor) đặc hiệu cho thực khuẩn thể (bacteriophage), có ý nghĩa quan trọng trong phân loại vi khuẩn.

1.2.5. Vỏ (capsule)

Vỏ của vi khuẩn là một lớp nhầy lỏng lẻo, không rõ rệt bao quanh vi khuẩn, được quan sát bằng phương pháp nhuộm mực nho. Chỉ có một số loài vi khuẩn và trong những điều kiện nhất định mới hình thành vỏ. Khuẩn lạc của những vi khuẩn có vỏ thường nhầy, ướt và sáng.
Vỏ của vi khuẩn đóng vai trò bảo vệ cho vi khuẩn trong những điều kiện nhất định. Ngoài ra, vỏ của vi khuẩn còn có gữi được khả năng gây bệnh của vi khuẩn, ví như các chủng phế cầu không tổng hợp được vỏ đều không có khả năng gây bệnh vì chúng nhanh chóng bị thực bào bởi cơ chế bảo vệ của cơ thể.

1.2.6. Lông (flagella)

Lông là những sợi protein dài và xoán tạo thành từ các acid amin dạng D. Lông là cơ quan di dộng trong môi trường thích hợp, nó chỉ có ở một số loại vi khuẩn nhất định. Vị trí lông của các vi khuẩn cũng có đặc điểm khác nhau, là đặc điểm để phân loại vi khuẩn ví dụ như phẩy khuẩn tả có lông ở một đầu, nhiều loại vi khuẩn khác có lông quanh thân như (Salmonella, E.coli), một vài vi khuẩn khác lại có một chùm lông ở đầu.

1.2.7. Pilli

Pili là cơ quan phụ của vi khuẩn như lông, nó có thể mất đi nhưng không ảnh hưởng tới sự tồn tại của vi khuẩn.

Chức năng chính của pili là để bám vào các tế bào có màng nhân (eucaryote), khả năng gây bệnh của một số loại vi khuẩn cũng liên quan đến sự tồn tại của pili, nếu vi khuẩn lậu mất pili sẽ không thể gây bệnh được.

1.2.8. Nha bào

Nhiều loại vi khuẩn có khả năng tạo nha bào khi điều kiện sống của chúng không thuận lợi. Mỗi vi khuẩn chỉ tạo được một nha bào, khi điều kiện sống thuận lợi, nha bào vi khuẩn lại nẩy mần để đưa vi khuẩn trở lại dạng sinh sản.
Nha bào có thể tồn tại lâu tới 150.000 năm, do ở dạng nha bào không có sự chuyển hoá và mất nước.

1.3. Sinh lý của vi khuẩn

Vi khuẩn là một sinh vật, nên chúng cũng có khả năng dinh dưỡng, hô hấp, chuyển hoá và sinh sản như các sinh vật khác

1.3.1. Dinh dưỡng của vi khuẩn

Trong quá trình sinh sản và phát triển, vi khuẩn cần một lượng thức ăn bằng trọng lượng cơ thể chúng, vì vi khuẩn phát triển nhanh. Trong tự nhiên có thể có những vi khuẩn có thể tổng hợp được mọi enzym từ một hợp chất carbon để hình thành chất chuyển hoá tham gia vào quá trình chuyển hoá. Tuy nhiên cũng có những vi khuẩn (biến chủng) chỉ phát triển trong những môi trường có các chất cần thiết gọi là yếu tố phát triển. Ví dụ, Escherichia coli là một vi khuẩn đường ruột không cần yếu tố phát triển; ngược lại, Proteus vulgaris cũng là vi khuẩn đường ruột gần với E. Coli nhưng chỉ phát triển trong môi trường có amid nicotinic vừa đủ.
Vi khuẩn là đơn bào, nên dinh dưỡng nhờ cơ chế thẩm thấu của màng nguyên sinh chất. Mỗi loại vi khuẩn có tính thẩm thấu khác nhau. Vi khuẩn non có tính thảm tháu cáo hơn vi khuẩn già. Những thức ăn không hoà tan thì không thẩm thấu được, vi khuẩn phải dùng enzym của mình để làm tan thức ăn rồi mới hấp thu thẩm thấu được.

1.3.2. Hô hấp của vi khuẩn

Hô hấp là quá trình trao đổi chất, tạo năng lượng cần thiết để tổng hợp nên các chất mới của tế bào. Các vi khuẩn gây bệnh lấy năng lượng từ một cơ chất carbon bằng cách oxy hoá.
Nhiều loại vi khuẩn dùng oxy của khí trời để oxy hoá lại coenzym khử, chúng là những vi khuẩn hiếu khí. Tuy nhiên một số loại vi khuẩn không thể sử dụng oxy tự do, nên chúng không thể phát triển được hoặc kém phát triển trong môi trường có oxy tự do. Những vi khuẩn này gọi là vi khuẩn kỵ khí tuyệt đối. Tuy nhiên, có một số loại vi khuẩn hiếu khí có thể phát triển được trong điều kiện không có không khí – đó là những vi khuẩn hiếu khí, kị khí tùy ngộ, ví dụ trực khuẩn mủ xanh là vi khuẩn có hai khả năng hô hấp hiếu khí và kỵ khí.

1.3.3. Chuyển hoá của vi khuẩn

Vi khuẩn sinh sản và phát triển được nhờ có hệ thống enzym. Mỗi loại vi khuẩn khác nhau có hệ thống enzym khác nhau. Bản chất của enzym là protein. Những enzym có khối lượng phân tử lớn dễ bị phá hủy bởi nhiệt độ. Enzym của vi khuẩn được chia thành nhiều loại dựa theo tính chất phản ứng như enzym thủy phân, oxy hoá, khử hydro, khử CO[sub]2[/sub], thêm CO[sub]2[/sub]... hoặc theo chất bị tác dụng như enzym phân hủy protein, glucid, lipid, acid nucleic... hoặc dựa theo vị trí của enzym ở trong vi khuẩn hay ngoài vi khuẩn để chia ra enzym nội bào hay enzym ngoại bào. Enzym nội bào tham gia vào quá trình chuyển hoá trong cơ thể của vi khuẩn. Enzym ngoại bào dùng để phân hủy các chất có phân tử lượng lớn thành các chất có phân tử nhỏ để dễ hấp thu.
Có một số chất được vi khuẩn hình thành trong quá trình chuyển hoá như nội độc tố, ngoại độc tố và chất kháng kháng sinh. Ngoại độc tố được vi khuẩn tiết ra ngoài tế bào là một protein tan được trong nước, độc tính của ngoại độc tố rất cao, chỉ cần 0,02 mg ngoại độc tố bạch hầu cũng gây chết người hoặc với độc tố uốn ván chỉ cần 0,00006 mg cũng gây chết người. Nội độc tố là chất độc của trực khuẩn gram âm. Tác dụng độc lực của nội độc tố không mạnh bằng ngoại độc tố, như nội độc tố thương hàn phải cần 400 mg mới gây chết người. Nội độc tố nằm trong vách của vi khuẩn, chỉ khi vi khuẩn bị phá vỡ nó mới được giải phóng.

1.3.4. Sự phát triển của vi khuẩn

Vi khuẩn muốn phát triển đòi hỏi phải có môi trường có đủ các yếu tố dinh dưỡng được gọi là môi trường dinh dưỡng hay môi trường cơ bản có pH từ 7,2 – 7,4. Môi trường canh thang là môi trường lỏng và thạch thường là môi trường canh thang cho thêm thạch để làm đặc lại.

Vi khuẩn chỉ phát triển trong những điều kiện thích hợp về nhiệt độ, phần lớn vi khuẩn gây bệnh có nhiệt độ phát triển thích hợp là 37[sup]o[/sup]C, tuy nhiên chúng có thể phát triển ở nhiệt độ 20[sup]o[/sup]C - 42[sup]o[/sup]C, cá biệt có thể ở 4[sup]o[/sup]C. Ngoài ra, các vi khuẩn còn cần khí trường thích hợp để phát triển như với vi khuẩn hiếu khí cần oxy, các vi khuẩn kỵ khí không cần oxy hoặc một số vi khuẩn cần có CO[sub][sub]2[/sub].[/sub]
1.3.4.1. Sự phát triển của vi khuẩn trong môi trường lỏng

Trong nghiên cứu hoặc chẩn đoán, môi trường lỏng chỉ có giá trị khi nó chứa một chủng vi khuẩn (chỉ có một clon) và như vậy ta có một canh khuẩn thuần khiết. Trong thực tế, đa số bệnh phẩm đều nhiễm nhiều loại vi khuẩn nên không thể cấy vào môi trường lỏng trừ một số ngoại lệ như máu bệnh nhân, dịch não tủy. Tuy nhiên, vẫn có thể có kết quả sai do nhiễm khuẩn từ ngoài vào trong quá trình lấy mẫu.
Để đo sự phát triển của vi khuẩn trên môi trường lỏng thường đo độ đục của canh khuẩn để xác định mật độ quang học D. Đây là phương pháp nhanh và chính xác, áp dụng được từ 10[sup]7[/sup] vi khuẩn trong 1 ml trở lên. D luôn tỷ lệ với khối lượng vi khuẩn, nhưng không tỷ lệ tuyệt đối với số lượng vi khuẩn.

1.3.4.2. Sự phát của vi khuẩn trong môi trường đặc

Nhờ độ quánh của môi trường đặc, trong quá trình phát triển, vi khuẩn nhanh chóng tạo thành khuẩn lạc có quan sát bằng mắt thường. Nếu ria cấy vi khuẩn trên môi trường đặc để vi khuẩn nọ đủ cách xa vi khuẩn kia, thì mỗi vi khuẩn sẽ tạo thành một khuẩn lạc riêng rẽ (một clôn). Dựa vào tính chất cơ bản này để tạo được canh khuẩn thuần khiết, gồm các vi khuẩn cùng mang gen di truyền giống nhau (trừ biến dị) và tính chất sinh lý giống nhau. Do vậy, môi trường đặc có rất nhiều ứng dụng trong phân lập các vi khuẩn gây bệnh với các loại môi trường như môi trường thạch thường, thạch sâu và môi trường chọn lọc.

1.3.5. Xác định tính chất sinh vật hoá học của vi khuẩn

Mỗi loại vi khuẩn có một quá trình chuyển hoá riêng, dựa vào tính chất sinh vật hoá học của chúng để xếp loại vi khuẩn.

2. CÁC PHƯƠNG PHÁP CƠ BẢN TRONG CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN
2.1. Phương pháp phân lập vi khuẩn

Phân lập là khâu quan trọng trọng trong quá trình nghiên cứu vi khuẩn. Mục đích của phân lập là tách riêng các vi khuẩn từ quần thể ban đầu tạo thành các clon thuần khiết để khảo sát và định loại. Khi vi khuẩn tăng trưởng và phát triển trên bề mặt môi trường rắn đã tạo ra những khuẩn lạc, hình thái của các khuẩn lạc mang tính đặc trưng của từng loài vi khuẩn. Việc mô tả chính xác các khuẩn lạc đã tách rời có thể góp phần rất quan trọng trong việc định danh vi khuẩn. Các nhà vi khuẩn học đã tiêu chuẩn hoá có ý nghĩa khi miêu tả hình dáng, độ cao và bờ, rìa của khuẩn lạc.

Hình thái khuẩn lạc

Điều quan trọng trong quá trình nuôi cấy vi sinh vật là tránh không đưa thêm vi sinh vật ngoại nhiễm vào môi trường nuôi cấy. Muốn vậy, ngoài các thao tác luôn phải được tiến hành trong điều kiện vô trùng, mọi yếu tố từ môi trường, dụng cụ chứa, dụng cụ nuôi cấy đến các vật dụng cần thiết khác đều phải được khử trùng thích hợp để được vô trùng trước khi sử dụng.

2.1.1. Các dạng mẫu cho nuôi cấy

Dạng dịch mẫu đã được đồng nhất, dịch nuôi cấy hoặc môi trường lỏng chứa chủng vi sinh vật cần phân tích - Dạng trên bề mặt môi trường rắn chứa thạch (1,5-2%) trong ống thạch nghiêng hay trong đĩa petri.
Dạngmẫu nằm sâu trong môi trường rắn trong ống nghiệm thạch sâu chứa thạch mềm (0,5-0,7%).

2.1.2. Dụng cụ cấy

Que cấy thẳng: Que cấy kim loại có đầu nhọn, thường dùng để cấy vi khuẩn có tạo khuẩn - Que cấy móc: que cấy có đầu vuông góc, thường dùng để cấy vi khuẩn có tạo khuẩn ty.

Que cấy vòng (Que khuyên cấy): que cấy kim loại đầu có vòng tròn, thường dùng cấy chủng từ môi trường rắn hoặc lỏng lên môi trường rắn, lỏngQue cấy trang: bằng kim loại hay thủy tinh, đầu hình tam giác, dùng để dàn trải vi khuẩn trên bề mặt thạch rắn.

Ống hút thủy tinh dùng để chuyển một lượng vi khuẩn nhất định lên bề mặt môi trường rắn hoặc vào môi trường lỏng. Hiện nay, pipet cấy chuyển với những đầu tip vô trùng có thể tháo rời để thay đổi (còn gọi là pipet đầu rời hay transfer pipet dạng hút thông thường).
Đầu tăm bông vô trùng để cấy giống từ môi trường lỏng lên bề mặt của môi trường rắn.

2.1.3. Các thao tác vô trùng

Thao tác cấy được thực hiện trong một không gian vô trùng tạo bởi ngọn lửa đèn cồn hoặc đèn Bunsen. Ngọn lửa đèn cồn, đèn Bunsen có tác dụng oxy hóa không khí tạo không gian vô trùng, đồng thời còn được dùng để đốt khử trùng que cấy, miệng chai lọ, ống nghiệm khi mở, đóng, nút bông, nắp nhựa…
Để tránh việc gây nhiễm thông qua tiếp xúc, nhân viên thao tác cần mang găng tay hoặc tiến hành sát trùng tay bằng cồn 70[sup]o[/sup] hoặc các dung dịch diệt khuẩn, tương tự như vậy tiến hành sát trùng mặt bàn thao tác trước khi bắt đầu thao tác vô trùng. Sau khi hoàn tất việc cấy chủng, tiến hành sát trùng tay, mặt bàn làm việc tương tự như trên trước khi rời phòng kiểm nghiệm.

2.1.4. Kỹ thuật cấy ria trên đĩa petri
- Dùng que cấy vòng thao tác vô trùng nhúng vào dịch mẫu để có được các vi khuẩn cần phân lập.

Ria các đường trên đĩa petri chứa môi trường thạch thích hợp. Sau mỗi đường ria liên tục, đốt khử trùng que cấy và làm nguội thực hiện đường ria tiếp theo.

- Lật ngược đĩa, ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp trong tủ ấm.

2.1.5. Kỹ thuật cấy trang

Dùng pipet chuyển 0,1ml dịch canh khuẩn lên bề mặt môi trường thạch trong đĩa pettri.

Nhúng đầu thanh gạt vào cồn, hơ qua ngọn lửa để khử trùng. Để đầu thanh gạt nguội trong không gian vô trùng của ngọn lửa.

Mở đĩa petri, đật nhẹ nhàng thanh gạt lên bề mặt thạch của đĩa petri. Dùng đầu thanh gạt trải đều dịch vi khuẩn lên bề mặt thạch. Trong khi thực hiện xoay đĩa một vài lần, mỗi lần khoảng nửa chu vi đĩa tạo điều kiện cho thanh gạt trải dịch vi khuẩn đều khắp bề mặt môi trường.

- Lật ngược đĩa, ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp trong tủ ổn nhiệt.

2.2. Cấy chuyển

2.2.1. Cấy giống từ môi trường lỏng sang ống nghiệm chứa môi trường lỏng

Đốt nóng đỏ đầu que cấy trong ngọn lửa và hơ nhẹ phần cán (phần sẽ đưa vào bên trong dụng cụ chứa vi sinh vật). Cầm thẳng đứng que cấy cho que cấy nóng đều.

Tay trái cầm ống nghiệm xoay nhẹ, tay phải cầm que cấy. Ngón út của tay phải dùng để mở nút bông.

Mở nút bông xoay miệng ống nghiệm qua ngọn lửa.

Đưa que cấy đã khử trùng vào bên trong ống nghiệm, làm nguội que cấy bằng cách áp đầu que cấy vào thành ống cho nguội. Thu sinh khối bằng cách nhúng que cấy vào môi trường lỏng, rút thẳng que cấy ra không để dính vào thành và miệng ống. Hơ nóng miệng ống nghiệm, đậy nút bông. Đặt ống nghiệm vào giá đỡ.

Đầu que cấy có chứa vi khuẩn được giữ ở vùng không khí vô trùng gần ngọn đèn. Dùng tay trái lấy ống nghiệm chứa môi trường mới, mở nút bông, khử trùng miệng ống nghiệm rồi đưa đầu que cấy vào bên trong môi trường.

Nhúng và khuấy nhẹ que cấy trong dịch môi trường để tách sinh khối ra khỏi đầu que cấy.

Rút thẳng đầu que cấy ra. Khử trùng miệng ống nghiệm, đậy nút bông lại.

Khử trùng que cấy ngay sau khi cấy xong.

2.2.2. Cấy giống từ môi trường lỏng sang ống thạch nghiêng
Tiến hành tương tự như trên với một số khác biệt sau: cấy giống lên bề mặt thạch nghiêng bằng cách đặt nhẹ đầu que cấy lên bề mặt môi trường ở đáy ống, sau đó cấy theo hình chữ chi từ đáy ống nghiệm lên đến đầu trên của mặt thạch nghiêng.

2.2.3. Cấy giống từ môi trường lỏng bằng pipet đầu rời
Pipet đầu rời cho phép thao tác chính xác với những dung tích nhỏ. Trong thao tác vô trùng, pipet đầu rời rất hữu dụng vì cho phép cấy chuyển dễ dàng dịch vi khuẩn lên bề mặt môi trường rắn trong đĩa petri nhằm tạo khuẩn lạc rời hoặc vào ống nghiệm hay bình chứa môi trường lỏng để nuôi tăng sinh. Bằng một pipet đầu rời người ta có thể thực hiện với số lần không hạn chế các thao tác vô trùng này do có thể hấp khử trùng đồng loạt với số lượng lớn các đầu tip. Trước khi sử dụng, kiểm nghiệm viên cần biết các yêu cầu cơ bản khi thao tác với pipet đầu rời như sau:

Mỗi pipet đầu rời đều có giới hạn dung tích thao tác cho phép nhất định. Thông thường các dải dung tích đó là: 0,1 Dải dung tích thao tác cho phép này thường được ghi rõ trên pipet đầu rời. Trong dải dung tích cho phép, kiểm nghiệm viên có thể điều chỉnh để có dung tích chính xác cần thao tác. Cần chọn pipet đầu rời với giới hạn dung tích thích hợp cho phạm vi thao tác. Mỗi loại pipet đầu rời đều có đầu tip tương ứng và có thể được khử trùng bằng nồi hấp áp suất.

Pipet đầu rời thường có hai nấc: nấc 1 tương đương với dung tích được chọn sử dụng khi hút dung dịch, nấc 2 vượt quá nấc 1 được sử dụng khi bơm dung dịch ra khỏi đầu tip của pipet đầu rời.

Khi sử dụng pipet đầu rời để cấy chuyển dịch giống cần tiến hành thao tác trong không gian vô trùng của ngọn lửa trong tủ cấy:

Tay phải cần pipet đầu rời, tay trái mở hộp chứa đầu tip vô trùng. Cắm đầu pipet vào đầu tip.

Dùng tay trái giữ ống nghiệm, bình chứa dịch giống vi sinh vật. Dùng ngón út và áp út của tay phải đang giữ pipet để kẹp giữ và mở nút bông, hơ nóng khử trùng miệng ống nghiệm hoặc bình chứa.

Đưa đầu tip vô trùng vào bên trong dịch giống, hút lấy dung tích cần thiết.

Rút đầu tip ra khỏi miệng bình chứa, khử trùng miệng bình chứa và đậy bằng nút bông đang được giữ ở ngón út và áp út của tay phải.

Đầu tip có chứa vi sinh vật được giữ ở vùng không khí vô trùng gần ngọn đèn.

Dùng tay trái lấy ống nghiệm hoặc bình chứa môi trường mới, dùng ngón út và áp út kẹp và mở nút bông, khử trùng miệng bình chứa.

Đưa đầu tip vào bên trong môi trường và bơm dịch giống vào môi trường.

Rút đầu tip ra khỏi miệng bình chứa, khử trùng miệng bình, đậy nút bông.

Thay đầu tip vô trùng mới khi thực hiện đợt cấy tiếp theoThực hiện tương tự trong trường hợp cấy chuyển dịch giống lên bề mặt môi trường trong đĩa petriCần lưu ý đầu pipet đầu rời và đầu tip được chế tạo bằng polymer nên tuyệt đối khử trùng đầu pipet và đầu tip bằng ngọn lửa.

Để đảm bảo sự phát triển của vi khuẩn, sau khi cấy xong phải quan tâm đến các điều kiện môi trường nuôi vi khuẩn bao gồm: (1) Nhiệt độ, phải chọn nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của mỗi loài vi khuẩn và duy trì ổn định nhiệt độ đó; (2) Độ ẩm, để duy trì độ ẩm trong quá trình nuôi ủ, cần đảm bảo đủ lượng nước khi làm môi trường. (3) Khí oxy đối với vi sinh vật hiếu khí, lớp môi trường nuôi cấy có độ dày vừa phải để oxy không khí có thể thấm vào.

2.3. Quy trình nhân giống và bảo quản chủng vi sinh vật chuẩn

2.3.1. Nguồn gốc
Chủng chuẩn cung cấp cho phòng thí nghiệm phải có nguồn gốc từ các nhà cung cấp hay tổ chức cung cấp giống vi khuẩn có uy tín, có chức năng cung cấp chủng giống vi khuẩn.

Giống được cung cấp phải đảm bảo yêu cầu về chất lượng, hoạt tính, có thông tin về các đặc điểm về sinh hóa, tính chất kháng nguyên.

Khi được nhà cung cấp chuyển đến phòng thí nghiệm các ống chủng vi khuẩn phải có nhãn ghi đầy đủ tên, mã số, ký hiệu chủng loại kèm theo hướng dẫn bảo quản, số lần cấy chuyền (số thế hệ) và các đặc điểm sinh hóa, kháng nguyên.

2.3.2. Nhân giống và bảo quản

Chủng giống dạng đông khô từ các ngân hàng giống được coi là giống gốc. Từ đây chủng được nhân lên trong môi trường canh thang (lần cấy chuyền thứ nhất).

Vi sinh vật từ môi trường canh thang được cấy chuyển vào môi trường thạch dinh dưỡng Tryptose Soy Agar (TSA – 1 đĩa và 15 ống thạch nghiêng) và môi trường chọn lọc.

Môi trường thạch không chọn lọc: ủ ở 37[sup]0[/sup]C 24 giờ, kiểm tra độ thuần chủng trên đĩa TSA. Số lượng ống chủng phụ thuộc vào nhu cầu của phòng. Kiểm tra lại và loại bỏ những ống củng không đạt yêu cầu. Bảo quản các ống chủng ở 4[sup]0[/sup]C, thời gian bảo quản tối đa là 3 tháng. Các chủng này được dùng làm đối chứng trong các lần phân tích mẫu.

- Môi trường thạch chọn lọc: cấy chủng từ môi trường canh thang trên lên môi trường thạch chọn lọc. Sau khi ủ, chọn một số khuẩn lạc để kiểm tra lại mức độ thuần khiết, các đặc tính sinh hóa và đặc tính kháng nguyên.

Khi ống chủng sắp hết thời gian bảo quản cho một lần cấy chuyển, các chủng giống được nhân lên trong môi trường canh thang dinh dưỡng và cấy chuyền vào các ống thạch nghiêng để bảo quản tương tự như trên.
Với một chủng vi khuẩn chuẩn chỉ được cấy tối đa 5 lần kể từ lần nhân giống đầu tiên. Sau mỗi lần cấy chuyển đều phải kiểm tra lại hoạt tính và độ thuần chủng. Khi hết thời hạn cấy chuyển phải thay chủng giống mới.

2.3.4. Sử dụng chủng chuẩn trong phân tích mẫu

Các chủng chuẩn trong môi trường thạch nghiêng trước khi sử dụng làm mẫu chứng dương được cấy sang môi trường thạch đĩa không chọn lọc (Plate Count Agar, Tryptose Soy Agar hay Nutrien Agar) nhằm kiểm tra độ thuần khiết, các đĩa này được bảo quản và sử dụng trong một tuần.

2.3.5. Chú ý khi sử dụng chủng chuẩn

Các chủng chuẩn phải được sử dụng và bảo quản cẩn thận ở 4[sup]0[/sup]C, mỗi ống chủng phải có nhãn mác ghi các thông tin như: tên, ký hiệu chủng, ngày, số lần cấy chuyển…

Kiểm nghiệm viên phải thận trọng và tuân thủ các quy định về an toàn phòng kiểm nghiệm khi cấy chuyển thao tác với các chủng chuẩn để tránh nhiễm bệnh hay làm lây lan mầm bệnh.

Dụng cụ sau khi tiếp xúc với các chủng vi khuẩn phải đựơc thanh trùng cẩn thận. Dụng cụ thủy tinh và các đĩa petri sau khi dùng phải được hấp khử trùng ở 121[sup]o[/sup]C 20 phút trước khi đem rửa, dụng cụ thủy tinh được ngâm trong dung dịch chlorin, sau đó rửa bằng xà phòng và tráng lại bằng nước sạch trước khi phơi khô.

2.4. Phương pháp soi tươi

Có thao tác đơn giản, tiến hành nhanh, thường được sử dụng để quan sát trạng thái sống của tế bào vi khuẩn.

2.4.1. Phương pháp thực hiện

2.4.1.1. Dụng cụ

- Lam kính: dùng làm tiêu bản.
- Lam phủ (lamel, kính phủ vật): dùng để đậy lên các tiêu bản.
- Lam kính lõm: dùng để quan sát khả năng di động của vi khuẩn.

2.4.1.2. Chuẩn bị giọt canh khuẩn từ môi trường nuôi cấy

Đặt ống chứa vi khuẩn vào giữa ngón cái và ngón trỏ của bàn tay trái, lòng bàn tay ngửa ra, ống nghiệm để hơi nghiêng nhưng không được để cho canh khuẩn chạm vào nút bông của ống nghiệm nuôi cấy vi khuẩn.

Khử trùng que cấy trên ngọn đèn cồn. Để que cấy thẳng đứng trên ngọn lửa cho đến khi đầu que cấy nóng đỏ rồi từ từ đặt và di chuyển que cấy theo chiều nằm ngang trên ngọn lửa.

Kẹp nút bông vào giữa ngón út và lòng bàn tay phải, xoay nhẹ nút một vòng và kéo nút ra. Giữ nút như vậy cho đến khi đậy nút vào.

Đốt miệng ống nghiệm trên ngọn lửa đèn cồn.

Đưa que cấy đã nguội vào ống nghiệm để lấy mẫu. Nếu ống giống là môi trường lỏng thì chỉ cần nhúng đầu que cấy vào canh trường rồi rút ra. Nếu giống mọc trên môi trường đặc thì dùng que cấy lấy một ít sinh khối vi sinh vật trên mặt thạch và hòa đều vào giọt nước cất vô trùng trên lam kính. Chú ý thao tác hết sức nhẹ nhàng để khi lấy mẫu vi khuẩn không làm rách mặt thạch.

- Rút que cấy ra, đốt miệng ống nghiệm, đậy ống nghiệm lại và đặt ống vào
vào giá.

Đặt giọt canh khuẩn (hoặc sinh khối vi sinh vật) ở đầu que cấy vào giữa phiến kính để làm tiêu bản.

Khử trùng lại que cấy trên ngọn đèn rồi cất vào giá.

2.4.1.3. Tiêu bản giọt ép

Dùng que cấy hoặc ống hút káy giống vi sinh vật để làm vết bôi.

Đặt một mép kính phủ vật tiếp xúc với lam kính một góc 45[sup]0 [/sup]rồi từ từ hạ xuống phủ giọt canh khuẩn thật nhẹ nhàng, tránh không tạo thành bọt khí.

2.4.1.4. Tiêu bản giọt treo
Dùng phiến kính đặc biệt có phần lõm hình tròn ở giữa.

Cho một giọt canh khuẩn lên giữa kính phủ vật. Thận trọng xoay ngược lá kính cho giọt canh khuẩn quay xuống phía dưới rồi đặt lên phần lõm của phiến kính.

Chú ý không giọt canh khuẩn lan rộng hay chạm vào đáy của phần lõm.

Đặt tiêu bản lên kính hiển vi và quan sát ở vật kính 10x hoặc 40x.
Trên thị trường hiện nay đã xuất hiện một dụng cụ có tên gọi là vòng O (O-ring) dùng để thực hiện giọt treo mà không cần lam kính lõm.Đây là một miếng đệm hình tròn, có kích thước vòng trong 12 mm, cao 3 mm có thể sử dụng nhiều lần. Khi thực hiện, người ta đặt vòng O lên giữa lam kính thường, đưa giọt canh khuẩn vào một mặt của kính phủ vật, xoay ngược kính phủ vật và úp lên vòng O. Đây là cải tiến của nhà sản xuất Science Kit, một bộ O- ring 25 chiếc có giá khoảng 20 USD 2.5. Phương pháp nhuộm gram[/b]



Năm 1884, Hans Christian Joachim Gram, một nhà khoa học người Đan Mạch đã sáng chế ra phương pháp nhuộm vi khuẩn mới mà ngày nay tên gọi đã trở lên rất quen thuộc với mọi phòng thí nghiệm vi khuẩn thế giới:



Phương pháp nhuộm gram là một trong những kỹ thuật cơ bản và quan trọng nhất trong phân tích vi khuẩn ở giai đoạn đầu nhằm xác định sơ bộ đặc tính của các dòng vi khuẩn muốn nghiên cứu theo tính chất bắt mầu gram của chúng. Vi khuẩn bắt mầu hỗn hợp crystal violet - iodin sẽ có màu tím nâu khi quan sát dưới kính hiển vi quang học và được xếp vào nhóm vi khuẩn gram dương. Những dòng vi khuẩn khác không giữ được mầu crystal violet và bắt mầu fuchsin (đỏ) được xếp vào nhóm vi khuẩn gram âm.

Phương pháp nhuộm gram dựa vào khả năng lưu giữ crystal violet của thành tế bào các dòng vi khuẩn sau khi bị tẩy bằng cồn. Việc xác định thời gian tẩy mầu là yếu tố quan trọng trong việc phân biệt vi khuẩn gram dương và vi khuẩn gram âm. Nếu kéo dài thời gian tẩy mầu, ngay cả vi khuẩn gram dương cũng không giữ được mầu nhuộm ban đầu. Ngoài ra, một số loài vi khuẩn gram dương cũng có thể bị tẩy mầu dễ dàng và vì thế chúng được coi là các dòng vi khuẩn có tính chất bắt mầu gram thay đổi (có thể âm lẫn dương). Chất nhuộm fuchsin (hoặc có thể thay bằng safranin) tạo cho vi khuẩn gram âm có mầu hồng đỏ. Fuchsin nhuộm mầu mạnh hơn và có mầu dễ nhìn hơn safranin. (Haemophilus spp., và một vài dòng vi khuẩn kỵ khí không ăn màu safranin)
[align=JUSTIFY] 2.5.1. Kỹ thuật nhuộm gram

2.5.1.1. Pha dung dịch thuốc nhuộm

a) Dung dịch Cristal violet:

* Dung dịch A:

- Crystal violet………………2 g

- Ethanol 95% ………………20 ml

* Dung dịch B:

- Ammonium oxalat …………………0,8

- Nước cất……………………………..80 ml

Trộn đều 2 dung dich A và B, lọc qua giấy lọc thô, giữ ở nhiệt độ phòng trong chai mầu nâu.

b) Dung dịch Lugol:

- Indin tinh thể……………………….1 g

- Potasium iodid……………………...2 g

- Nước cất..............................................300 ml

Nghiền Iodin vào Potassium iodid trong 50 ml nước cất cho hòa tan hoàn toàn. Thêm phần nước cất còn lại, giữ ở nhiệt độ phòng trong chai nâu. Khi dung dịch mất mầu phải pha lại.

c) Dung dịch Carbon fuchsin:

* Dung dich A:

- Fuchsin………………………………0,3 g

- Ethanol 95%........................................10 ml

* Dung dịch B

[align=JUSTIFY