12-17-2012, 12:55 PM
KỸ THUẬT NUÔI CẤY NẤM
Nuôi cấy nấm là kỹ thuật phức tạp nhằm mục đích phân lập và định loại nấm.
Nhìn chung, môi trường phân lập nấm tương đối nghèo chất dinh dưỡng và thường dùng môi trường Sabouraud có một số loại đường. Môi trường định loại nấm là những môi trường thích hợp để nấm phát triển tối đa về hình thể, khuẩn lạc phát triển đầy đủ, bộc lộ những đặc tính giúp cho việc định loại được dễ dàng. Trong phạm vi bài này chỉ giới thiệu kỹ thuật nuôi cấy nấm trên những môi trường phân lập đơn giản để phát hiện sự có mặt của nấm trong bệnh phẩm sau khi nuôi cấy. Môi trường thường được dùng là Sabouraud đổ đĩa, ưu điểm của các môi trường đĩa là vừa nhận xét được phần mặt và rìa khuẩn lạc, vừa quan sát được phần đáy (mặt sau) khuẩn lạc.
1. Chuẩn bị dụng cụ
1.1. Dụng cụ
- Que cấy, đèn cồn.
- Ống nghiệm, đĩa petri vô khuẩn.
- Tủ ấm, tủ sấy.
1.2. Môi trường
- Môi trường Sabouraud có đường:
Pepton: 10g.
Glucose hoặc maltose: 40g.
Thạch sợi: 20g.
Nước thường: 1000mL.
- Môi trường Sabouraud để bảo quản:
Pepton: 30g.
Thạch sợi: 20g.
Nước cất: 1000mL.
- Môi trường Sabouraud có kháng sinh:
Pepton: 10g.
Glucose: 20g.
Chloramphenicol: 50mg.
Thạch sợi: 20g.
Nước cất: 1000mL.
- Có thể thay thế chloramphenicol bằng:
Streptomycin: 40 đơn vị/ 1mL môi trường.
Penicillin: 20 đơn vị/ 1mL môi trường.
Các thành phần của từng môi trường được đun nóng để hoà tan các chất, sau đó nếu cần thì cho thêm kháng sinh, hấp ở 115oC trong 10- 15 phút đổ đĩa hoặc ống để nghiêng, bảo quản ở tủ lạnh.
1.3. Bệnh phẩm: Có thể là phân, nước tiểu, dịch ...
2. Quy trình kỹ thuật (Trên môi trường thạch đĩa)
- Chuẩn bị dụng cụ, môi trường, bệnh phẩm.
- Để môi trường từ tủ lạnh vào tủ ấm 30 phút.
- Đánh dấu môi trường cho phù hợp.
- Đốt đỏ que cấy, để nguội, lấy bệnh phẩm.
- Dùng ngón cái và ngón trỏ tay trái hé mở nắp môi trường.
- Ria cấy dày trên mặt theo phương pháp 3 vùng, đậy nắp môi trường.
- Đốt que cấy.
- Để tủ ấm 37oC hoặc để ở nhiệt độ phòng, theo dõi 3- 5 ngày hoặc có thể lâu hơn.
- Nhận xét khuẩn lạc, soi tươi hoặc nhuộm soi.
- Ghi kết quả vào phiếu XN.
* Kỹ thuật nuôi cấy nấm trên lam kính:
- Đặt một khúc đũa thuỷ tinh uốn cong hình chữ U vào trong một hộp petri, hấp vô khuẩn.
- Đổ vào hộp petri một ít nước vô khuẩn làm ướt đáy hộp.
- Lấy một lam kính đốt trên ngọn lửa đèn cồn để khử khuẩn rồi đặt lên khúc đũa thuỷ tinh
- Đổ thạch sabouraud có 2% đường vào một hộp petri vô khuẩn khác, để cho đông.
- Dùng dao vô khuẩn cắt thạch ra từng miếng có kích thước khoảng 1cm2, đặt miếng thạch vào giữa lam kính.
- Đặt bệnh phẩm hoặc nấm cần nuôi cấy lên miếng thạch.
- Dùng kẹp gắp một lamen hơ trên ngọn lửa đèn cồn để diệt khuẩn, để nguội rồi đặt lên miếng thạch đã nuôi cấy nấm. Để ở nhiệt độ phòng hoặc 37oC từ 1-3 ngày.
- Dùng kẹp vô khuẩn gắp lamen ra đặt lên một lam kính sạch khác đã có sẵn 1 giọt LPCB, soi kính hiển vi.
3. Nhiệt độ và thời gian ủ nấm.
- Tất cả mẫu cấy được ủ ở 30oC bởi vì nhiệt độ này thích hợp cho hầu hết vi nấm gây bệnh phát triển, nếu không có thể ủ ở nhiệt độ phòng(25oC). Trước đây chúng ta thường ủ 4 tuần nhưng một nghiên cứu gần đây cho rằng chỉ cần 3 tuần là đủ cho hầu hết vi nấm gây bệnh phát triển, ngoại trừ da, tóc, móng và bệnh phẩm tìm vi nấm nhị độ. Đối với bệnh phẩm tìm nấm men như dịch hầu họng, dịch âm đạo chỉ cần ủ 7ngày. Nên kiểm tra mẫu cấy ít nhất 2 hoặc 3 ngày mỗi lần trong 2 tuần đầu và hàng tuần trong các tuần tiếp theo.
Khuẩn lạc nấm xuất hiện:
+ Sau 2-5 ngày: thường là nấm men hoặc nấm hoại sinh
+ Sau 1,5 - 2 tháng: nhóm nấm gây bệnh ngoài da, Ví dụ T.schoenleinii
+ Sau 2 tháng không thấy nấm mọc: kết luận âm tính.
4. Cách quan sát một canh cấy nấm.
4.1. Khảo sát đại thể :
4.1.1. Cấu tạo mặt trên :
+ Nhăn ở giữa cao lên như miệng núi lửa. Ví dụ: T. Tonsurans
+ Nhăn nheo từ trung tâm ra ngoại vi. Ví dụ: Penicillium sp
+ Giống như rắc bột: do vi nấm sinh nhiều bào tử. Ví dụ: T. Mentagrophytes
+ Giống nhung: do vi nấm sinh sợi tơ ngắn. Ví dụ: M. Canis
+ Giống len: do vi nấm sinh sợi tơ dài. Ví dụ: Mucor sp, Rhizopus sp
+ Giống sáp. Ví dụ: T. Schoenleinii.
4.1.2. Màu sắc khúm nấm.
- Mặt trên của khuẩn lạc nấm:
+ Màu sắc rất đa dạng tuỳ theo loại nấm: trắng vàng, vàng nâu, xanh lá cây, đỏ, đen...
+ Một khuẩn lạc nấm có thể có 2 màu. Ví dụ Aspergillus sp: Phía trong có màu xanh hoặc nâu, phía ngoài có màu trắng.
+ Trên mặt khuẩn nấm có thể đọng những giọt nước. Ví dụ: Penicillium. sp
- Mặt dưới của khuẩn lạc nấm:
+ Sinh sắc tố: có những loại vi nấm không sinh sắc tố nhưng cũng có loại sinh sắc tố như: Penicillium có màu vàng và nâu. Trychophyton sp có màu đỏ, nâu. Epidermophyton sp có màu vàng, xanh lá cây.
+ Phân bố sắc tố: Xung quanh khuẩn lạc: Epidermophyton. Lan ra hết ống nghiệm hoặc đĩa cấy: Trichoderma
4.2. Khảo sát dưới kính hiển vi.
Dùng que cấy lấy một mẫu khuẩn lạc nấm đặt lên một lam kính đã có sẵn một giọt LPCB, đậy lamen. Quan sát dưới kính hiển vi vật kính 10x hoặc 40x. Nếu thấy rõ bào tử và những cơ cấu đặc biệt khác, người ta có thể định danh được nấm nhưng nhiều khi cần làm thêm:
- Cấy nấm trên miếng kính để xem vị trí của bào tử
- Dùng môi trường đặc biệt để cho sinh bào tử hay sinh ra cơ cấu đặc sắc của một loại nấm
- Khảo sát về tính sinh hoá học hay đặc tính khác của nấm
- Thử nghiệm trên vật nuôi.
