Qui trình PCR phát hiện Vibrio Cholerae

[tuyenlab]

1. MỤC ĐÍCH: Phát hiện các gen đặc hiệu và gen độc tố tả (cholera toxin A) của V. cholerae O1, O139 và NAG.

2. PHẠM VI ÁP DỤNG

Phát hiện V. cholerae và độc tố tả từ các chủng vi khuẩn hoặc trực tiếp từ phân, thực phẩm, nước.

3. NGUYÊN TẮC
Sử dụng các đoạn mồi đặc hiệu để khuếch đại các đoạn gen mã hóa V. cholera O1, O139, NAG và độc tố tả (cholera toxin A) bằng phản ứng chuỗi men. Quá trình này được lặp lại nhiều lần để tổng hợp hàng triệu bản sao của đoạn gen từ một vài phân tử ADN ban đầu qua đó có thể phát hiện được các đoạn gen dưới đèn UV sau khi điện di.

4. TRÁCH NHIỆM Cán bộ thực hiện: Thực hiện thao tác xét nghiệm. Đảm bảo các mẫu bệnh phẩm được dán nhãn đúng và ghi vào sổ nhận mẫu. Hoàn tất báo cáo trả lời kết quả xét nghiệm. Đảm bảo kiểm soát chất lượng nội bộ phù hợp với tiêu chuẩn.

Trưởng phòng thí nghiệm: Duyệt lại các kết quả xét nghiệm.
Cập nhật các thay đổi của qui trình.
5. AN TOÀN Mặc áo choàng, mang găng tay và khẩu trang khi tiếp xúc với các mẫu bệnh phẩm.
Mang găng tay suốt quá trình thao tác kỹ thuật PCR.
6. THÔNG TIN MẪU BAN ĐẦU

7. TRANG THIẾT BỊ-HÓA CHẤT-SINH PHẨM7.1. Thiết bị: Máy luân nhiệt :Mastercycler eppendorf Máy chụp gen Máy điện di Máy ly tâm eppendorf 10.000 Máy lắc có điều chỉnh nhiệt độ Máy khuấy từ Máy trộn vortex Máy đo pH Cân điện Tủ lạnh 4[sup]0[/sup]C, -20[sup]0[/sup]C và -80[sup]0[/sup]C Tủ ấm

7.2. Dụng cụ: Que cấy vi khuẩn Micropipette:: 2,5; 10-50; 100-200 và 1000l Đầu týp các cỡ Tube eppendorf các cỡ: 0,2; 0,5; 1,5ml Hộp để đầu týp Giá để đầu tube Ống nghiệm 12 Hộp lồng, bình cầu, ống đong Chai 0,5lít, 1 lít
Găng tay các cỡ

7.3. Sinh phẩm hóa chất Bảng 1: Các đoạn mồi dùng trong kỹ thuật PCR phát hiện gen đặc hiệu của V. choleare

Canh thang LB (promega)
Thạch dinh dưỡng
NaCl 0,09% Kít tách chiết ADN (QIAGEN) Dung dịch đệm TAE 10X Nước cất Thạch điện di (electrophoresis agar) Thang chuẩn ADN 100bp Ethidiumbromide Chứng dương: V. cholerae [/i]O1: VN01/07 V. cholerae [/i]O139: AI4450 Chứng âm: E. coli 8. TIẾN HÀNH KỸ THUẬT PCR

8.1. Tách chiết ADN khuôn mẫu:

8.1.1. Tách chiết từ chủng vi khuẩn

Lấy 4-5 khuẩn lạc trộn đều với 200µl nước cất.

Đun cách thủy ở 95[sup]0[/sup]C trong 5 phút.

Ly tâm 10.000 vòng/2 phút lấy nước nổi làm khuôn mẫu ADN.

8.1.2. Tách chiết trực tiếp từ phân: Sử dụng kit QIAGEN

Nhỏ 300µl dịch phân tiêu chảy vào týp eppendorf 1,5ml có chứa 600µl NaCL 0.09%.

Ly tâm 2500 vòng x 2 phút để loại bỏ cặn.

Hút dịch nổi sang một týp eppendorf mới.

Ly tâm 13.000 vòng x 10 phút để loại bỏ nước nổi, thu cặn vi khuẩn.

Trộn đều cặn vi khuẩn trong 180µl dung dịch ALT.

Nhỏ 20µl protein K trộn đều bằng máy trộn voltex.

Ủ 56[sup]0[/sup]C trong máy ủ nhiệt cho đến khi vi khuẩn ly giải hoàn toàn (thỉnh thoảng mĩ nhẹ bằng máy trộn voltex).

Trộn đều bằng máy trộn voltex trong 15 giây, nhỏ 200µl dung dịch AL, trộn đều sau đó nhỏ 200µl cồn tuyệt đối và trộn đều.

Hút toàn bộ hỗn hợp nhỏ vào cột DNeasy Mini spin coumn, ly tâm 8000 vòng x 1 phút.

Nhỏ 500µl dung dịch AW1, ly tâm 8000 vòng x 1 phút.

Rửa cột bằng cách nhỏ 500µl dung dịch AW2, ly tâm 14000 vòng x 3 phút.

Chuyển cột sang týp PCR sạch và nhỏ 75µl dung dịch AE vào trung tâm cột, để ở nhiệt độ phòng 1 phút, ly tâm 8000 vòng x 1 phút thu ADN tách chiết để làm khuôn mẫu cho phản ứng PCR.

8.2. Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng PCR 8.2.1. Cách pha mồi (primers) cho phản ứng PCR: Bảng 2: Cách pha mồi

Trộn đều chia mỗi tube 27µl.
Cho 3µl ADN khuôn mẫu vào các tube chứa hỗn dịch PCR.

8.4. Điện di sản phẩm PCR

Chuẩn bị gel agarose 2%:

Cân 1g thach cho vào dung dịch TAE 1X, lắc đều và đun hòa tan thạch bằng lò vi sóng.

Để thạch nguội khoảng 70[sup]0[/sup]C đổ khuôn tạo gel.

Nhỏ mẫu:

Đặt bản gel vào buồng điện di có dung dịch đệm TAE 1X.
Rỏ 5µl thang ADN chuẩn 100bp, các chứng âm, chứng dương và sản phẩm PCR vào các giếng thạch.

Chạy điện di: Chạy điện di ở hiệu điện thế 100V trong vòng 30 phút.

Nhuộm và chụp ảnh gel:

Nhuộm gel trong dung dịch ethidium bromide (10mg/ml) trong 10 phút rồi rửa bằng nước cất trong 15 phút.
Soi và chụp ảnh gel bằng máy chụp gel BioDoc-it[sup]TM[/sup] System.

9. PHÂN TÍCH KẾT QUẢ Chứng dương phải rõ ràng. Có vạch trên gel và đúng kích thước khi so sánh với thang ADN chuẩn Vạch có hình ảnh rõ nét, đẹp như hình 1.

Hình 1: Kết quả PCR các chủng chứng dương và chứng âm của V. cholerae O1, O139 và E. coli Nếu vạch mờ, không rõ: Tăng thể tích điện di. Thực hiện lại phản ứng PCR. Mẫu chứng âm không được có vạch nào, nếu thấy vạch là mẫu đã bị nhiễm và phải làm lại xét nghiệm. Các mẫu xét nghiệm được xác định dương tính khi xuất hiện các vạch có kích thước tương ứng với các mẫu chứng và thang chuẩn ADN, ghi: (+).
Các mẫu không có vạch hoặc có vạch không đúng kích thươc được coi là âm tính, ghi (-).
10. KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG Độ nhạy: 100vk/ml Độ đặc hiệu: 100% Mẫu chứng: Chứng âm: E. coli (không có vạch) Chứng dương: V. cholerae[/i] O1: VN107-07(kích thước band 192bp) V. cholerae[/i] O139: AI4450 (kích thước band 490bp) CtxA: AI4450 (kích thước band 564bp)