Qui trình nuôi cấy phân lập vi khuẩn Neisseria meningitidis

[tuyenlab]

Hình 4. Phản ứng sinh hóa Cystine Trypticase Agar (bộ CTA)

Xác định typ huyết thanh (nếu có điều kiện):

Tuỳ theo cấu trúc kháng nguyên vỏ hay protein màng ngoài, não mô cầu có 13 typ huyết thanh. Typ huyết thanh được xác định bằng phản ứng ngưng kết trên phiến kính với kháng huyết thanh đặc hiệu, chú ý các typ A,B,C,Y, W135 như sau:

- Cấy thuần vi khuẩn não mô cầu (trên thạch máu hoặc sôcôla) qua đêm hoặc từ 8 – 12 giờ.

- Tạo huyền dịch vi khuẩn có độ đục tương đương độ đục 1 đến 2 Mc Farland trong nước muối sinh lý có 0,05% formalin.

- Lau sạch phiến kính bằng cồn và chia 3 ô (cho 3 chủng vi khuẩn hoặc cho 3 typ kháng thể).

- Đặt 15µl huyền dịch vi khuẩn gần trung tâm mỗi ô.

- Đặt 15µl kháng huyết thanh đặc hiệu bên cạnh huyền dịch vi khuẩn (sử dụng từng typ huyết thanh hoặc A hoặc B hoặc C).

- Dùng que nhựa hoặc tăm gỗ trộn đều.

- Theo dõi hiện tượng ngưng kết trong vòng 1 đến 2 phút tuỳ theo hướng dẫn của Nhà sản xuất sinh phẩm (thường phản ứng ngưng kết giữa vi khuẩn và kháng thể đặc hiệu xảy ra trong vòng 1 phút).

- Cần có chứng âm : vi khuẩn trộn trong nước muối sinh lý 0,5% formalin (không có hiện tượng ngưng kết).

3.3. Sơ đồ tóm tắt quy trình xét nghiệm

3.4. Tiêu chuẩn xác định vi khuẩn não mô cầu

- Đặc điểm khuẩn lạc: tròn vồng nhẹ, xám nhạt (gần giống khuẩn lạc vi khuẩn H. influenzae có vỏ) nhưng không có mùi đặc biệt, không gây tan huyết môi trường nuôi cấy. Não mô cầu phát triển được trên cả thạch máu (cừu hay thỏ) 5% và thạch sôcôla.

- Hình thể vi khuẩn: ở dạng song cầu hình hạt đậu hay hạt cà phê xếp úp vào nhau, bắt màu Gram âm (Hình 1,2).

- Thử nghiệm Oxidase: cytochrome oxidase (+).

-Thử nghiệm phản ứng sinh hoá 4 loại đ­­ường (vi khuẩn sử dụng carbohydrate sinh axit, đỏ phenol là chỉ thị màu):

*Glucose (+), Maltose (+): màu vàng.

*Lactose (-), Sucrose (-): màu đỏ.

3.5. Chú ý:

Điều kiện nuôi cấy để phân lập não mô cầu:
*Nhiệt độ 35-37[sup]0[/sup]C/ 5% C0[sub]2[/sub]/ 50% độ ẩm. Sử dụng tủ ấm C0[sub]2[/sub] hoặc tủ ấm thường và bình kín đốt nến. Đọc kết quả phân lập sau 16-24h.

Chú ý: Nếu có điều kiện để phát hiện kháng nguyên đặc hiệu hoặc gen đặc hiệu của não mô cầu, ly tâm dịch não tủy 15.000 vòng x 10 phút, dịch nổi sau ly tâm xử lý ở nhiệt độ 100[sup]0[/sup]C/3’ và thực hiện phản ứng ngưng kết phát hiện kháng nguyên não mô cầu các typ A,B,C, W135 và Y. Phần “cặn” cất ở -70[sup]0[/sup]C để xử lý tách chiết ADN của vi khuẩn thực hiện PCR (nếu nuôi cấy âm tính hoặc có thể thực hiện ngay PCR với phần ”cặn”cùng thời gian với nuôi cấy phân lập).

4. Báo cáo kết quả (phiếu trả lời kết quả):

5. Kiểm soát chất lượng:

Để kiểm soát chất lượng cần đảm bảo:

- Có chủng vi khuẩn chuẩn (để kiểm soát chất lượng các điều kiện phân lập vi khuẩn từ bệnh phẩm).

- Môi trường nuôi cấy phân lập và sinh phẩm xác định phải còn hạn và được giữ theo đúng những yêu cầu về điều kiện bảo quản của Nhà sản xuất.

- Môi trường nuôi cấy phân lập và sinh phẩm xác định phải được kiểm tra chất lượng ngay sau khi nhận về hoặc ngay sau khi pha chế (đối với môi trường nuôi cấy phân lập).

- Đảm bảo các điều kiện phát triển của vi khuẩn trong quá trình ủ (nhiệt độ, khí trường…).

- Bệnh phẩm được lấy và bảo quản đúng cách.

- Có sổ sách ghi chép quá trình làm xét nghiệm (nhật ky phòng xét nghiệm).

6. Các yêu cầu về an toàn:

Tuân thủ các yêu cầu về an toàn sinh học cho người thực hiện và môi trường làm việc:

- Nơi thực hiện xử lý mẫu phải được cách ly với khu vực bàn giấy văn phòng.

- Người thực hiện trong quá trình làm việc phải có quần áo, mũ, khẩu trang, găng tay y tế.

- Các dụng cụ (ăng cấy, pipet…) hoặc được đốt qua đèn cồn hoặc phải được ngâm trong dung dịch khử trùng ngay sau khi thực hiện hoặc bỏ ngay vào túi rác chuyên dụng.

- Lau dọn vệ sinh khử trùng khu vực xử lý mẫu bệnh phẩm bằng hóa chất thích hợp ngay sau khi kết thúc xét nghiệm.

7. Chất thải phát sinh và phương pháp xử lý (tóm tắt)

- Bệnh phẩm và/hoặc chất đựng bệnh phẩm, dụng cụ xét nghiệm dùng 1 lần: sau khi xét nghiệm xong phải được cho vào thùng khử trùng chuyên dụng để khử trùng trước khi thải bỏ.

- Môi trường nuôi cấy bệnh phẩm: sau khi đã có kết quả phân lập phải được tập trung vào các thùng đựng chuyên dụng để hấp sấy khử trùng.

8. Tài liệu tham khảo

1. Josephine A. Morello, William M. Janda, and Gary V. Doern. Neisseria and Branhamella. (1991) Manual of Clinical Microbiology Fifth Edition. 258-276.

2. Robert S. Baltimore and Harry A. Feldman. (1991) Meningococcal Infections. Bacterial Infection of Human Epidemiology and Control, second edition p. 425- 440.

3.WHO/CDS/CSR/EDC/99.7.(1999). Identification of N. meningitidis. Laboratory Manual for the Diagnosis of meningitis Caused by Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae and Haemophilus influenzae. page 19-22.

PGS. TS. Phan Lê Thanh Hương
Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương