Clostridium difficile PCR

[tuyenlab]

Clostridium difficile PCR

I. MỤC ĐÍCH VÀ NGUYÊN LÝ

1. Mục đích

Phát hiện gen mã hóa cho 2 loại độc chất A và B của vi khuẩn Clostridium difficile từ mẫu phân.

2. Nguyên lý

Bằng kỹ thuật PCR sử dụng bộ kit C. difficile A/B (VD).

II. CHUẨN BỊ

1. Người thực hiện
- Người thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.
- Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.

2. Phương tiện, hóa chất

Phương tiện, hóa chất như ví dụ dưới đây hoặc tương đương.

2.1. Trang thiết bị

- Máy real-time PCR và hệ thống máy vi tính.

- Bộ lưu điện

- Máy ủ nhiệt

- Máy ly tâm dùng cho tube 0,2 ml

- Máy ly tâm 25000 x g

- Tủ lạnh 2oC -8oC

- Tủ âm sâu (-20o C) hoặc (-70oC) (nếu có)

- Máy vortex

- Tủ an toàn sinh học

- Micropipettes các thể tích từ 5 ul - 1000 ul.

2.2. Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)

C. difficile A/B kit (VD)

Nước cất

Khay đựng bệnh phẫm

Tube ly tâm 1.5 ml

PRC tube thể tích 200 ul

Đầu côn có lọc1000 µl

Đầu côn có lọc 200 µl

Đầu côn có lọc 10 µl

Micropipette 2-20 µl

Micropipette 10-100 µl

Micropipette 100-1000 µl

Sổ lưu kết quả xét nghiệm

Cồn 90 độ (vệ sinh dụng cụ)

Cồn sát trùng tay nhanh

Dung dịch nước rửa tay

Khăn lau tay

Giấy trả kết quả xét nghiệm

Bông

Giấy y tế

Giá đỡ PCR tube

Kẹp nhựa, marker

Tube Eppendorf

Tube đặt phản ứng

Khẩu trang

Găng tay không bột tal

Quần áo bảo hộ

Mũ

QC (nếu thực hiện) *

EQAS (nếu thực hiện) *

* Ghi chú:

- Chi phí nội kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình nội kiểm (QC) là 1/10 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lượng ≥ 10 mẫu cho 1 lần tiến hành kỹ thuật).

- Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/200 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 2 lần/1 năm).

3. Bệnh phẩm

- Thu thập các mẫu phân vào các ống chứa kín, không cần chất bảo quản.
- Mẫu phải được bảo quản ở 2-8oC và làm xét nghiệm ngay lập tức hoặc giới hạn trong 24 giờ. Trong trường hợp khác, mẫu phải được đông lạnh ngay lập tức và được trữ lên tới 10 ngày ở nhiệt độ -20oC hoặc lạnh hơn. Sự rã đông không được ảnh hưởng đến kết quả.

4. Phiếu xét nghiệm

Điền đầy đủ thông tin theo mẫu phiếu yêu cầu

III. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.

1. Lấy bệnh phẩm

Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh.

2. Tiến hành kỹ thuật

2.1. Chuẩn bị mẫu

2.2. Tách chiết DNA

2.3. Cài đặt máy luân nhiệt

2.4. Chuẩn bị cho PCR mix

2.5. Chạy phản ứng PCR

IV. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

Kết quả chỉ có giá trị nếu:

- Mẫu blank phải dương tính ở kênh HEX, nhưng âm tính ở kênh FAM

- Chứng dương phải dương tính ở kênh FAM

Nếu 2 điều kiện gặp nhau, kết quả có giá trị và có khả năng phân tích kết quả. Ngoài ra các kết quả khác đều không có giá trị

V. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

Vấn đề 1: Không tín hiệu

- Sai kênh được chọn

- Hút sai dẫn tới bỏ quên 1 số thuốc thử hoặc mẫu

- Tác động ức chế của mẫu: DNA không đủ lượng hoặc không đủ độ tinh sạch

- Kiểm tra bộ kit được bảo quản đúng

- Kiểm tra hoạt động của máy luân nhiệt

Vấn đề 2: Mật độ huỳnh quang quá thấp

- Hư thuốc nhuộm và/hoặc primers trong thuốc thử do điều kiện bảo quản không phù hợp

- Lượng mẫu và.hoặc độ tinh sạch thấp của DNA

Vấn đề 3: Mật độ huỳnh quang thay đổi

- Master mix không được phối trộn tốt

- Bọt khí có trong ống PCR

Theo quyết định số 26 /QĐ-BYT ngày 03 tháng 01 năm 2013