12-03-2015, 11:43 PM
NHUỘM GOMORI CHÌ PHÁT HIỆN PHOSPHATAZA AXIT
I. NGUYÊN LÝ
Photphataza axit thường có mặt ở màng tế bào của mô thận cũng như nhiều mô khác của cơ thể. Enzym thủy phân cơ chất Sodium β - glycero- photphat để sinh ra β - glycerol không hòa tan. Sản phẩm phản ứng đầu tiên này sẽ liên kết với chì nitrat để tạo ra màu đen của phẩm azo không hòa tan, đồng thời chúng đọng lại tại vị trí enzym. Như vậy, qua màu sắc của phẩm nhuộm, người ta biết được vị trí và mức độ hoạt động của enzym cần nghiên cứu.
II. CHUẨN BỊ
1. Người thực hiện
+ Bác sĩ giải phẫu bệnh – tế bào bệnh học: 01
+ Kỹ thuật viên giải phẫu bệnh – tế bào bệnh học: 01
2. Phương tiện, hoá chất
- Máy cắt lạnh đã ở trạng thái sẵn sàng hoạt động
- Dao sắc, thớt nhựa sạch, phẳng
- Bộ dụng cụ phẫu tích bệnh phẩm
- Phiến kính, lá kính sạch
- Bút chì mềm (để ghi tên tuổi Người bệnh, mã số tiêu bản trên phiến kính).
- Giấy thấm, gạc sạch
- Găng tay, khẩu trang, mũ, kính bảo vệ mắt và quần áo bảo hộ.
- Chổi lông mềm
- Gel cắt lạnh
- Cồn tuyệt đối
- Gắn lá kính: thạch glixerin.
- Phẩm nhuộm (hoặc dùng phẩm nhuộm có sẵn của các hãng hoặc pha như hướng dẫn dưới đây) bao gồm: Sodium β-glycerophotphat, chì nitrat, đệm acetat pH 5,0; ammonium sunfit, xanh metyl hoặc carmalum theo Mayer.
III. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
1. Chuẩn bị
- Bệnh phẩm sau khi lấy ra từ BN được gửi ngay đến khoa giải phẫu bệnh – tế bào bệnh học.
- Kỹ thuật viên tiếp nhận, ghi các thông tin về Người bệnh vào sổ đăng ký và mã số Người bệnh.
- Ghi mã số của Người bệnh vào phiến kính và dán mã số vào hộp đựng bệnh phẩm.
2. Cắt lọc bệnh phẩm
- Bác sĩ giải phẫu bệnh – tế bào bệnh học quan sát bệnh phẩm, mô tả kỹ về loại bệnh phẩm, số lượng, đo kích thước, màu sắc, tính chất, mặt cắt… của bệnh phẩm, xác định vùng tổn thương cần lấy mẫu cắt lạnh.
- Động tác lấy bệnh phẩm phải nhẹ nhàng, tránh gây dập nát hay biến đổi do tác động cơ học.
- Không kẹp vào vùng định lấy mẫu xét nghiệm, không rửa mẫu mô.
- Dùng dao sắc cắt theo một hướng, sao cho đường cắt gọn, không bị dập nát
- Kích thước của mảnh mô được cắt tùy theo kích thước của vật gá mẫu bệnh phẩm của máy cắt lạnh, thông thường kích thước 1 x 1 x 0,2 cm.
- Số lượng mảnh cắt tuỳ từng trường hợp.
3. Làm lạnh mẫu bệnh phẩm và cắt mảnh mô
- Đặt mẫu bệnh phẩm vào gá đúc lạnh rồi đưa ngay vào vị trí tương ứng trên thanh làm lạnh (Cryobar) trong buồng làm lạnh của máy, phủ gel cắt lạnh, xoay khối Head tracter đặt lên trên khuôn đúc chứa bệnh phẩm rồi đóng kín cửa kính phía trên buồng máy, chờ cho đến khi khối bệnh phẩm đông cứng (có màu trắng).
- Mẫu mô sau khi đã đông cứng được cắt thành những lát thật mỏng. Bắt đầu cắt thô với độ dày từ 10-15 micromet để tạo mặt phẳng. Sau đó điều chỉnh độ dày lát cắt từ 2-5 micromet. Quay máy cắt với nhịp độ vừa phải.
- Kết hợp với chổi lông mềm dàn mảnh mô lên phiến kính.
- Cố định mảnh mô: (để cấu trúc mô và tế bào giữ nguyên hình dáng và bắt màu thuốc nhuộm), sau khi lát cắt được dàn lên phiến kính, phải được cố định ngay bằng cồn tuyệt đối 95-960 hoặc cồn acetic-formol trong 20 giây.
4 Nhuộm mảnh cắt
4.1. Chuẩn bị phẩm nhuộm
Chuẩn bị dung dịch ủ
0,05M đệm acetat pH 5,0: 10 ml
Sodium β-glycerophotphat: 32 mg
Chì nitrat: 20 mg
Lưu ý: chì nitrat phải được hòa tan trong dung dịch đệm trước khi cho thêm sodium β-glycerophotphat. Môi trường ủ phải có độ pH gần bằng 5,0.
4.2. Tiến hành kỹ thuật
1. Ủ mảnh cắt trong dung dịch ủ, ở 37 ºC, khoảng nửa giờ - 2giờ
2. Rửa bằng nước cất.
3. Nhúng trong dung dịch ammonium sunfit 1% trong 2 phút.
4. Rửa kỹ trong nước cất.
5. Nhuộm đối màu hoặc bằng xanh metyl 2% hoặc carmalum theo Mayer.
6. Rửa dưới vòi nước.
7. Gắn lá kính bằng thạch glixerin.
IV. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
Photphataza axit: màu đen
Nhân: xanh lá cây hoặc đỏ
V. MỘT SỐ LƯU Ý
Chì nitrat phải được hòa tan trong dung dịch đệm trước khi cho thêm sodium β-glycerophotphat. Môi trường ủ phải có độ pH gần bằng 5,0.
Nên lấy các chất phản ứng ra khỏi tủ lạnh và để ở nhiệt độ phòng trong thời gian trước khi tiến hành quy trình nhuộm để phản ứng enzym có thể diễn ra nhanh hơn.
Theo Quyết định Số: 5199 /QĐ-BYT