11-26-2015, 11:35 PM
NHUỘM XANH PHỔ PERL PHÁT HIỆN ION SẮT
I. NGUYÊN LÝ
Phản ứng Perl là một trong phản ứng hóa mô kinh điển đầu tiên. Mảnh mô được xử lý bằng dung dịch axit ferrocyanit sẽ bộc lộ ion sắt dưới dạng hydroxide [Fe(OH)3] bằng cách hòa tan axit hydrochloric. Sau đó, ion sắt phản ứng với dung dịch ferrocyanide kali để tạo ra phức màu xanh không hòa tan là ferrocyanide sắt (màu xanh Phổ).
II. CHUẨN BỊ
1. Người thực hiện
Kỹ thuật viên giải phẫu bệnh – tế bào bệnh học: 02
2. Phương tiện, hóa chất
2.1. Phương tiện, hóa chất chung cho kỹ thuật
- Dung dịch cố định bệnh phẩm.
- Cồn (70o, 80o, 95o , 100o).
- Xylen hay toluen.
- Nước cất 2 lần.
- Parafin.
- Sáp ong.
- Albumin + glyxerin.
- Máy đo độ pH điện tử.
- Máy chuyển bệnh phẩm tự động.
- Máy đúc khối parafin.
- Bàn hơ dùng điện.
- Máy cắt lát mỏng (microtome).
- Lưỡi dao cắt lát mỏng.
- Lò nấu parafin.
- Tủ ấm 370 và 560.
- Tủ lạnh.
- Điều hòa nhiệt độ.
- Tủ hốt phòng thí nghiệm.
- Nguồn cấp nước chảy.
- Bể nhuộm bằng thủy tinh.
- Bể thủy tinh đựng cồn, xylen.
- Hộp bằng thép không rỉ đựng parafin.
- Khuôn nhựa.
- Giá đựng tiêu bản (đứng và nằm ngang).
- Cốc đong loại 1000ml, 500ml, 100ml và 50ml.
- Ống hút bằng nhựa, quả bóp cao su hút hóa chất.
- Kẹp không mấu, kéo.
- Cân phân tích.
- Giấy lọc.
- Phiến kính, lá kính.
- Axit picric ngâm, làm sạch phiến kính.
- Bôm Canada hoặc keo gắn lá kính.
- Kính hiển vi 2 mắt để kiểm tra kết quả nhuộm.
- Kính phòng hộ, găng tay các loại, mặt nạ phẫu thuật, áo choàng phẫu thuật.
2.2. Phương tiện, hóa chất riêng biệt cho kỹ thuật
Phẩm nhuộm (hoặc dùng phẩm nhuộm có sẵn của các hãng hoặc pha như hướng dẫn ở III.6.1 dưới đây), bao gồm: ferrocyanid kali, axit hydrochloric, đỏ trung tính, đỏ nhanh (fast red).
III. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
1. Cố định
Bệnh phẩm được lấy ra khỏi cơ thể được cố định ngay trong dung dịch formol đệm trung tính 10% với tỷ lệ thể tích dung dịch cố định nhiều gấp 20 -30 lần thể tích bệnh phẩm. Thời gian cố định từ 2-12 giờ tuỳ theo mảnh bệnh phẩm to hay nhỏ.
Sau cố định, bệnh phẩm được thực hiện qua các khâu kỹ thuật sau:
2. Chuyển bệnh phẩm
3. Vùi parafin
4. Đúc khối parafin
5. Cắt và dán mảnh cắt
6. Nhuộm mảnh cắt
6.1. Chuẩn bị phẩm nhuộm
Dung dịch ferrocyanid
1% dung dịch nước ferrocyanid kali: 20 ml
2% dung dịch nước axit hydrochloric: 20 ml
Lưu ý: chuẩn bị dung dịch ngay trước khi sử dụng
6.2. Tiến hành kỹ thuật
Nên có mảnh cắt chứng với nước
1. Tẩy parafin mảnh cắt bằng 3 bể toluen (hoặc xylen), mỗi bể 2 phút
2. Chuyển vào các bể cồn 100°, 95°, 80° mỗi bể 2 phút
3. Rửa trong nước cất 3 – 5 phút
4. Xử lý mảnh cắt bằng dung dịch axit ferrocyanid mới pha x 30phút
5. Rửa kỹ trong nước cất
6. Nhuộm nhạt nhân bằng dung dịch đỏ trung tính 0,5% hoặc đỏ nhanh (fast
red) 0,1%.
7. Rửa nhanh trong nước cất.
8. Đẩy nước bằng cồn 95° và 100°
9. Làm trong bằng 3 bể toluen sạch
10. Gắn lá kính
IV. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
Ion sắt: xanh
Nhân: đỏ
V. MỘT SỐ SAI SÓT VÀ CÁCH XỬ TRÍ
Nên chuẩn bị dung dịch nhuộm ngay trước khi sử dụng do dung dịch axit hydrochloric mới pha sẽ có tác dụng hiệu quả hơn để tách liên kết protein với ion sắt, đồng thời, nên có mảnh cắt chứng nhuộm với nước.
Trong bước 7, nếu sử dụng vòi nước chảy để rửa sẽ làm cho nền tiêu bản có màu đỏ và sẽ mất độ tương phản của nhân tế bào.
Bước 9 có tác dụng biệt hóa màu đỏ khi khử nước.
Nên tránh các chất cố định có axit hoặc dichromate hoặc các dung dịch axit dùng để khử canxi. Các chất phản ứng như vậy có thể làm mất khả năng thủy phân ion sắt của mô, tạo ra kết quả âm tính giả.
Theo Quyết định Số: 5199 /QĐ-BYT