11-26-2015, 12:16 PM
NHUỘM VAN GIESON
I. NGUYÊN LÝ
Trong phẩm nhuộm hỗn hợp chất bazơ và axit, thành phần axit tích điện âm sẽ có ái lực cao với các cấu trúc mô tích điện dương (như các protein tích điện dương của bào tương tế bào), còn phẩm nhuộm bazơ sẽ có ái lực cao với thành phần axit (như nhân tế bào). Nhuộm Van Gieson là kỹ thuật nhuộm 3 màu phối hợp cả phẩm nhuộm bazơ và phẩm nhuộn axit, gồm:
- Nhuộm nhân: Hematoxylin Weight/ferric trioxyhematein (phẩm nhuộm bazơ)
- Nhuộm bào tương: axit picric (phẩm nhuộm axit)
- Nhuộm “chọn lọc” sợi tạo keo: axit picro – fuchsin (phẩm nhuộm axit) Cách nhuộm này được coi là có tính chọn lọc nhất đối với sợi tạo keo. Nhược điểm là nhanh bị phai màu. Để tránh hiện tượng này, người ta phải gắn tiêu bản bằng D.P.X
II. CHUẨN BỊ
1. Người thực hiện
Kỹ thuật viên giải phẫu bệnh – tế bào bệnh học: 02
2.1. Phương tiện, hóa chất chung cho kỹ thuật
- Dung dịch cố định bệnh phẩm.
- Cồn (70o0, 80o, 95o , 100o).
- Xylen hay toluen.
- Nước cất 2 lần.
- Parafin.
- Sáp ong.
- Albumin + glyxerin.
- Máy đo độ pH điện tử.
- Máy chuyển bệnh phẩm tự động.
- Máy đúc khối parafin.
- Bàn hơ dùng điện.
- Máy cắt lát mỏng (microtome).
- Lưỡi dao cắt lát mỏng.
- Lò nấu parafin.
- Tủ ấm 37o và 56o.
- Tủ lạnh.
- Điều hòa nhiệt độ.
- Tủ hốt phòng thí nghiệm.
- Nguồn cấp nước chảy.
- Bể nhuộm bằng thủy tinh.
- Bể thủy tinh đựng cồn, xylen.
- Hộp bằng thép không rỉ đựng parafin.
- Khuôn nhựa.
- Giá đựng tiêu bản (đứng và nằm ngang).
- Cốc đong loại 1000ml, 500ml, 100ml và 50ml.
- Ống hút bằng nhựa, quả bóp cao su hút hóa chất.
- Kẹp không mấu, kéo.
- Cân phân tích.
- Giấy lọc.
- Phiến kính, lá kính.
- Axit picric ngâm, làm sạch phiến kính.
- Chất gắn lá kính: D.P.X.
- Kính hiển vi 2 mắt để kiểm tra kết quả nhuộm.
- Kính phòng hộ, găng tay các loại, mặt nạ phẫu thuật, áo choàng phẫu thuật.
2.2. Phương tiện, hóa chất riêng biệt cho kỹ thuật
- Phẩm nhuộm (hoặc dùng phẩm nhuộm có sẵn của các hãng hoặc pha như hướng dẫn ở III.6.1 dưới đây): Hematoxylin Weight, axit picric, axit picro – fuchsin.
III. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
1. Cố định
Bệnh phẩm lấy ra khỏi cơ thể được đưa ngay vào dung dịch cố định (formol đệm trung tính 10%) với tỷ lệ thể tích dung dịch cố định nhiều gấp 20- 30 lần thể tích bệnh phẩm. Thời gian cố định từ 2-24 giờ tuỳ theo mảnh bệnh phẩm to hay nhỏ.
Sau khi cố định, bệnh phẩm được thực hiện qua các khâu kỹ thuật sau:
2. Chuyển bệnh phẩm
3. Vùi parafin
4. Đúc khối parafin
5. Cắt và dán mảnh cắt
6. Nhuộm mảnh cắt
6.1. Chuẩn bị phẩm nhuộm
a. Dung dịch picro – fuchsin van Gieson
Axit fuchsin: 100mg
Axit picric bão hòa trong nước: 100ml
HCl đậm đặc (d:1,19): 0,25ml
Nếu muốn màu sắc tương phản rõ hơn, nên sử dụng thêm một loại dung dịch được pha như sau:
Axit picric bão hòa trong nước: 5ml
Axit fuchsin: 0,75ml
Chú ý: dung dịch này chỉ pha trước khi dùng và chỉ sử dụng một lần
b. Ferric hematoxylin theo Weight
Dung dịch mẹ gồm dung dịch 1 và dung dịch 2:
Dung dịch 1:
Hematoxylin: 1g
Cồn etanol tuyệt đối: 100ml
Để dung dịch chín (ít nhất trong 8 ngày) trước khi dùng.
Dung dịch 2:
Dung dịch nước chlorua ferric 30% 4ml
Nước cất: 100ml
Axit chlohydric: 1ml
Trộn lẫn dung dịch 1 với dung dịch 2 trước khi nhuộm. Lưu ý, đổ từ từ dung dịch 2 vào dung dịch 1 sẽ dễ trộn hơn (không làm ngược lại). Cuối cùng cho ra dung dịch nhuộm có màu tím – đen. Để chín (dung dịch 1 cần để chín 8 ngày trước nhuộm). Thời gian nhuộm từ 20 – 30 phút. Kết quả nhuộm: nhân màu đen (phối màu tốt khi sử dụng trong các phương pháp nhuộm như van Gieson, Lillie,…).
6.2. Tiến hành kỹ thuật
1. Tẩy parafin bằng 3 bể toluen (xylen), mỗi bể 2 phút
2. Chuyển vào các bể cồn 100°, 95°, 80° mỗi bể 2 phút
3. Rửa nhanh trong nước cất
4. Nhuộm nhân bằng dung dịch hematoxylin Weight: 5 – 10 phút
5. Rửa nước chảy: 20 phút
6. Thấm bớt nước bằng giấy lọc rồi nhỏ lên tiêu bản dung dịch picro –fuchsin (van Gieson): 3 – 5 phút
7. Biệt hóa trong 2 bể cồn etanol 95°: mỗi bể 5 lần nhúng
8. Đẩy nước bằng cồn 95° và 100°
9. Làm trong tiêu bản bằng 3 bể toluen sạch
10. Gắn lá kính bằng D.P.X
IV. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
Nhân tế bào: xanh hoặc đen
Bào tương: vàng
Sợi tạo keo: đỏ đậm
Cơ vân, cơ trơn: vàng – nâu nhạt
Biểu mô vảy sừng hóa: vàng
Chất kính: vàng
V. NHỮNG SAI SÓT VÀ HƯỚNG XỬ TRÍ
Axit fuchsin dễ bị tách chiết bằng nước và axit picric lại bị tách chiết bởi cồn. Vì thế, bước rửa nước cần rất nhanh và tốt nhất nên dùng giấy thấm ngay để tránh mất màu của axit fuchsin. Hơn nữa, nên nhuộm nhân bằng hematoxylin sắt tốt hơn là dùng hematoxylin nhôm (alum) vì không bị tách chiết bởi axit picric.
Theo Quyết định Số: 5199 /QĐ-BYT