1. CHỈ ĐỊNH
Hiện nay có một xu hướng mới trong cấy đờm, đó là cấy định lượng. Dựa vào kết quả cấy định lượng có thể phân biệt tác nhân nào là tác nhân thật sự gây bệnh có trong mẫu đờm, tác nhân nào là ngoại nghiễm vùng hầu họng. phương pháp cấy định lượng mẫu đờm được chỉ định thông thường nhất là trên các viêm phổi nặng hay trên các viêm phổi bệnh viện. Trên viêm phổi cộng đồng thì không nhất thiết phải áp dụng phương pháp này.
2. THỜI ĐIỂM LẤY MẪU VÀ CÁCH LẤY MẪU
Tương tự phương pháp cấy không định lượng
3. ĐÁNH GIÁ MẪU ĐỜM
Trước khi tiến hành nuôi cấy, mẫu đờm cũng được đánh giá đại thể và sau đó làm một phết nhuộm gram để đánh giá vi thể như phương pháp cấy đờm không định lượng.
4. PHƯƠNG PHÁP CẤY ĐỊNH LƯỢNG
Trước hết làm tan đờm trong dung dịch nước muối sinh lý vô trùng vừa pha thêm NALC (Sputaprep – QT kit của Nam Khoa) và sau đó pha loãng đờm. Tiến hành như sau:
- Trong một tube 15ml vô trùng nắp xanh (loại Falcon) đã chứa 10ml nước muối sinh lý vô trùng (NS), cho thêm vào 50mg NACL (N-Acetyl –L-Cystein), tức là toàn bộ bột NALC chứa trọng một tube Eppendorf. Lắc nhẹ cho tan hoàn toàn. Dung dịch NS có NALC này chỉ dùng trong ngày và đủ cho 2-3 mẫu. Luôn luôn bảo quản tube dung dịch NALC đã pha trong tủ lạnh 40C.
- lấy một thể tích đờm cần nuôi cấy cho vào một tube vô trùng nắp vặn chặt (hay lọ vô trùng nắp đỏ). Thêm vào một thể tích như vậy dung dịch NS có NALC vừa mới pha. Lắc nhẹ cho đến khi đờm tan trong dung dụch này. Như vậy chúng ta đã có đờm đã pha loãng ½. Sau khi đờm tan hoàn toan, pha loãng tiếp mẫu đờm này thành 1/10 trong nước muối sinh lý vô trùng. Như vậy chúng ta đã có đờm pha loãng 1/20.
- Tiến hành cấy định lượng mẫu đờm đã pha loãng ½ trên các hộp thạch máu cừu (BA), thạch nâu máu ngựa có bacitracin (CAHI) và thạch MC bằng khuyên cấy định lượng10μl (0,01ml) và 1μl (0,001ml) hay dùng micropipett để hút cấy lên mặt thạch. Với mẫu đờm pha loãng 1/20, dùng khuyên cấy 1μl hay dùng micropipett để hút 1μl để cấy lên mặt thạch và cũng trên 3 loại hộp thạch như trên. Phương páhp cấy định lượng trên mặt thạc được thực hiện như cấy định lượng nước tiểu. Sau khi cấy, các hộp thạch BA và CAHI được ủ trong khí trường CO2 còn các hộp thạch MC được ủ trong khí trường bình thường, nhiệt độ ủ là 35-370C, thời gian ủ qua đêm hay tối đa 24 giờ. Đọc kết quả và định lượng các loại vi khuẩn mọc trên các hộp thạch như trong bảng 4 trình bày sau:
![[Image: Aloxovn.com-dom_1.PNG]](https://lh4.googleusercontent.com/-Fvz9BNtEClw/T8QrWhv54DI/AAAAAAAAPXU/7GbaHVVJAVI/s1600/Aloxovn.com-dom_1.PNG)
N là số nhóm của một loại vi khuẩn đếm được trên các hộp thạch. Để có con số định lượng của một loại vi khuẩn thì chúng ta nên lấy số trung bình của các kết quả. Ví dụ: ứng với các khóm nghi ngờ K. pneumoniae, kết quả trên hộp thạch MC1 là 200 khóm, lượng vi khuẩn K. pneumoniae trong 1ml đờm là 40000 CFU/ml (2x200x102); trên hộp thạch MC2 là 15, lượng vi khuẩn /ml đờm là 30000 CFU/ml (2x15x103); và trên hộp thạch MC3, lượng vi khuẩn là 60000 CFU/ml (2x3x103). Như vậy, kết quả cuối cùng lượng vi khuẩn K. pneumoniae trong mẫu đờm sẽ được tính là (40000+30000+60000)/3 = 43333 CFU/ml. Nếu các hộp thạc 1 và 2 có vi khuẩn quá nhiều (>200 khóm 2), chúng ta chỉ nên đếm số khóm trên hộp thạch 3.
5. BIỆN LUẬN KẾT QUẢ
Các vi khuẩn có lượng ≥ 1000 CFU/ml thì phải định danh và làm kháng sinh đồ. Có nghĩa là tiến hành định danh và làm kháng sinh đồ bất cứ khóm vi khủan nào mọc được trên hộp thạch 2 và 3 hay có số lượng ≥ 5 khóm trên hộp thạch1. Trả lời lâm sàng cả kết quả định lượng là bao nhiêu vi khuẩn đã định danh và làm kháng sinh đồ để lâm sàng có thể tùy nghi sử dụng.
6. CẤY ĐỊNH LƯỢNG MẪU ĐỜM – CÁC CÂU HỎI THƯỜNG GẶP
6.1. Trong trường hợp viêm phổi cộng đồng, có cần thiết phải cấy định lượng mẫu đờm?
- Viêm phổi cộng đồng nếu là nhẹ hay trung bình thì không nhất thiết phải cấy định lượng vì các vi khuẩn gây bệnh thường là S. pneumoniae, H. influenzae và M. catarrhalis. Các vi khuẩn này dù đều có thể là vi khuẩn thường trú vùng hầu họng nhưng khó có thể mọc được trên môi trường nuôi cấy nếu chúng ở dạng thường trú vì số lượng rất ít. Chính vì vậy chúng ta chỉ cần đánh giá mãu đờm qua phết nhuộm gram, nếu thấy tin cậy thì tiến hành nuôi cấy bình thường chứ không cần cấy định lượng.
- Đối với viêm phổi cộng đồng nặng, các viêm phổi bệnh viện thì rất cần thiết phải cấy định lượng mẫu đờm vì tác nhân vi khuẩn gây bệnh thường là cá trực khuẩn gram (-) dễ mọc hay là tụ cầu mà đây là các vi khuẩn có thể là các vi khuẩn tạm trú rất dễ mọc trên các hộp thạch phân lập dù số lượng vi khuẩn hiện diện ít trong mẫu.
6.2. Khi tiến hành cấy định lượng, có cần đánh giá mẫu đờm trước qua phết nhuộm gram không?
- Cấy định lượng nhằm mục đích là chỉ bắt các vi khuẩn có số lượng lớn trong mẫu đờm vì đây mới chính là tác nhân gây bệnh thật sự. Do vậy về nguyên tắc không nhất thiết phải đánh giá mẫu đờm trước khi cấy định lượng.
- Tuy nhiên vì qui trình cấy định lượng ngoài việc phải dùng bộ thuốc thử làm tan đờm, chúng ta còn phải sử dụng số lượng hộp thạch phân lập nhiều gấp 3 lần phương pháp cấy không định lượng, do vậy rất cần thiết phải đánh giá mẫu đờm để chỉ tìm tiếp tục qui trình cấy định lượng khi mẫu đờm được đánh giá là tin cậy hay tin cậy vừa, nhờ vậy chúng ta có thể tiết kiệm vì không phải tiến hành cấy định lượng mẫu không tin cậy.
6.3. Có khi nào trong kết quả cấy định lượng đờm cho kết quả số lượng vi khuẩn gây bệnh trên 1 000 hay 10000, mà kết quả đánh giá đờm pha phết nhuộm gram quan sát ở quang trường x100 lại không tin cậy không?
- Trên thực tế có phòng thí nghiệm cấy định lượng đờm cho kết quả như trên. Tuy nhiên với nghiên cứu mà chúng tôi đã tiến hành tại phòng thí nghiệm của mình thì 100% các mẫu không tin cậy đều cho kết quả định lượng với số lượng vi khuẩn (ứng với mỗi loại) <1000 CFU/ml.
- Kết quả này càng khẳng định là không nên cấy định lượng khi phết nhuộm gram mẫu đờm quan sát dưới kính hiển vi với quang trường x100 cho thấy có >10 tế bào biểu mô và <25 tế bào bạch cầu.
- Do vậy, có lẽ phòng thí nghiệm này đã quan niệm sai về cách tính số lượng vi khuẩn, thay vì là số lượng của từng loại vi khuẩn, họ lại tính số lượng của tất cả các loại vi khuẩn hiện diện trong mẫu đờm.
6.4. Cấy định lượng đờm có khả thi không với điều kiện hiện nay tại các phòng thí nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh viện?
- Trước đây, khó có thể cấy định lượng đờm vì đòi hỏi phải có thuốc thử làm tan đờm phải đặt mua nước ngoài và giá thành khá đắt. Hiện nay bộ thuốc thử làm tan đờm để cấy định lượng đờm đã được công ty Nam Khoa (đạt ISO 9001:2000) nghiên cứu thành công và sản xuất trong nước với sản phẩm mang tên SPUTAPREP – QT. Sản phẩm này rất tiết kiệm và tiện dụng nhờ được chia nhỏ để có thể thực hiện trên tối thiểu 2 mẫu đờm trong ngày.
- Nếu được trang bị SPUTAPREP – QT; và có thêm các loại môi trường phân lập là MC, BA máu cừu, CA giàu XV (các môi trường này cũng đã được công ty Nam Khoa sản xuất dưới dạng chế sẵn hay sẵn sàng để chế); các phòng thí nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh viện hoàn toàn có thể cấy định lượng được mẫu đờm mà không gặp bất cứ khó khăn hay trở ngại gì.
6.5. Khi nào nên chỉ định cấy định lượng đờm?
- Thật ra cấy định lượng đờm có thể chỉ định cho tất cả các trường hợp cấy đờm. Tuy nhiên như đã nói ở trên, cấy định lượng đờm tốm kém gấp 3 lần hơn cấy thông không định lượng. Do vậy, chúng ta không cần thiết cho cấy định lượng đối với các trường hợp viêm phổi cộng đồng nhẹ và vừa.
- Rất cần thiết phải cho cấy định lượng đờm các trường hợp viêm phổi nặng, các trường hợp viêm phổi bệnh viện, các trường hợp viêm phổi nằm tại các phòng cấp cứu và phòng chăm sóc tăng cường (ICU).
- Cũng nên cho cấy định lượng khi quan sát đại thể các mẫu đờm lấy được thấy có lẫn nước bọt.
- Một nguyên tắc mà chúng tôi cho là rất cần thiết phải tuân theo để tiết kiệm chi phí cho bệnh nhân và bệnh việ, đó là không cấy định lượng khi quan sát vi thể mẫu đờm qua phết nhuộm gram cho thấy là mẫu hoàn toàn không tin cậy.
Hiện nay có một xu hướng mới trong cấy đờm, đó là cấy định lượng. Dựa vào kết quả cấy định lượng có thể phân biệt tác nhân nào là tác nhân thật sự gây bệnh có trong mẫu đờm, tác nhân nào là ngoại nghiễm vùng hầu họng. phương pháp cấy định lượng mẫu đờm được chỉ định thông thường nhất là trên các viêm phổi nặng hay trên các viêm phổi bệnh viện. Trên viêm phổi cộng đồng thì không nhất thiết phải áp dụng phương pháp này.
2. THỜI ĐIỂM LẤY MẪU VÀ CÁCH LẤY MẪU
Tương tự phương pháp cấy không định lượng
3. ĐÁNH GIÁ MẪU ĐỜM
Trước khi tiến hành nuôi cấy, mẫu đờm cũng được đánh giá đại thể và sau đó làm một phết nhuộm gram để đánh giá vi thể như phương pháp cấy đờm không định lượng.
4. PHƯƠNG PHÁP CẤY ĐỊNH LƯỢNG
Trước hết làm tan đờm trong dung dịch nước muối sinh lý vô trùng vừa pha thêm NALC (Sputaprep – QT kit của Nam Khoa) và sau đó pha loãng đờm. Tiến hành như sau:
- Trong một tube 15ml vô trùng nắp xanh (loại Falcon) đã chứa 10ml nước muối sinh lý vô trùng (NS), cho thêm vào 50mg NACL (N-Acetyl –L-Cystein), tức là toàn bộ bột NALC chứa trọng một tube Eppendorf. Lắc nhẹ cho tan hoàn toàn. Dung dịch NS có NALC này chỉ dùng trong ngày và đủ cho 2-3 mẫu. Luôn luôn bảo quản tube dung dịch NALC đã pha trong tủ lạnh 40C.
- lấy một thể tích đờm cần nuôi cấy cho vào một tube vô trùng nắp vặn chặt (hay lọ vô trùng nắp đỏ). Thêm vào một thể tích như vậy dung dịch NS có NALC vừa mới pha. Lắc nhẹ cho đến khi đờm tan trong dung dụch này. Như vậy chúng ta đã có đờm đã pha loãng ½. Sau khi đờm tan hoàn toan, pha loãng tiếp mẫu đờm này thành 1/10 trong nước muối sinh lý vô trùng. Như vậy chúng ta đã có đờm pha loãng 1/20.
- Tiến hành cấy định lượng mẫu đờm đã pha loãng ½ trên các hộp thạch máu cừu (BA), thạch nâu máu ngựa có bacitracin (CAHI) và thạch MC bằng khuyên cấy định lượng10μl (0,01ml) và 1μl (0,001ml) hay dùng micropipett để hút cấy lên mặt thạch. Với mẫu đờm pha loãng 1/20, dùng khuyên cấy 1μl hay dùng micropipett để hút 1μl để cấy lên mặt thạch và cũng trên 3 loại hộp thạch như trên. Phương páhp cấy định lượng trên mặt thạc được thực hiện như cấy định lượng nước tiểu. Sau khi cấy, các hộp thạch BA và CAHI được ủ trong khí trường CO2 còn các hộp thạch MC được ủ trong khí trường bình thường, nhiệt độ ủ là 35-370C, thời gian ủ qua đêm hay tối đa 24 giờ. Đọc kết quả và định lượng các loại vi khuẩn mọc trên các hộp thạch như trong bảng 4 trình bày sau:
N là số nhóm của một loại vi khuẩn đếm được trên các hộp thạch. Để có con số định lượng của một loại vi khuẩn thì chúng ta nên lấy số trung bình của các kết quả. Ví dụ: ứng với các khóm nghi ngờ K. pneumoniae, kết quả trên hộp thạch MC1 là 200 khóm, lượng vi khuẩn K. pneumoniae trong 1ml đờm là 40000 CFU/ml (2x200x102); trên hộp thạch MC2 là 15, lượng vi khuẩn /ml đờm là 30000 CFU/ml (2x15x103); và trên hộp thạch MC3, lượng vi khuẩn là 60000 CFU/ml (2x3x103). Như vậy, kết quả cuối cùng lượng vi khuẩn K. pneumoniae trong mẫu đờm sẽ được tính là (40000+30000+60000)/3 = 43333 CFU/ml. Nếu các hộp thạc 1 và 2 có vi khuẩn quá nhiều (>200 khóm 2), chúng ta chỉ nên đếm số khóm trên hộp thạch 3.
5. BIỆN LUẬN KẾT QUẢ
Các vi khuẩn có lượng ≥ 1000 CFU/ml thì phải định danh và làm kháng sinh đồ. Có nghĩa là tiến hành định danh và làm kháng sinh đồ bất cứ khóm vi khủan nào mọc được trên hộp thạch 2 và 3 hay có số lượng ≥ 5 khóm trên hộp thạch1. Trả lời lâm sàng cả kết quả định lượng là bao nhiêu vi khuẩn đã định danh và làm kháng sinh đồ để lâm sàng có thể tùy nghi sử dụng.
6. CẤY ĐỊNH LƯỢNG MẪU ĐỜM – CÁC CÂU HỎI THƯỜNG GẶP
6.1. Trong trường hợp viêm phổi cộng đồng, có cần thiết phải cấy định lượng mẫu đờm?
- Viêm phổi cộng đồng nếu là nhẹ hay trung bình thì không nhất thiết phải cấy định lượng vì các vi khuẩn gây bệnh thường là S. pneumoniae, H. influenzae và M. catarrhalis. Các vi khuẩn này dù đều có thể là vi khuẩn thường trú vùng hầu họng nhưng khó có thể mọc được trên môi trường nuôi cấy nếu chúng ở dạng thường trú vì số lượng rất ít. Chính vì vậy chúng ta chỉ cần đánh giá mãu đờm qua phết nhuộm gram, nếu thấy tin cậy thì tiến hành nuôi cấy bình thường chứ không cần cấy định lượng.
- Đối với viêm phổi cộng đồng nặng, các viêm phổi bệnh viện thì rất cần thiết phải cấy định lượng mẫu đờm vì tác nhân vi khuẩn gây bệnh thường là cá trực khuẩn gram (-) dễ mọc hay là tụ cầu mà đây là các vi khuẩn có thể là các vi khuẩn tạm trú rất dễ mọc trên các hộp thạch phân lập dù số lượng vi khuẩn hiện diện ít trong mẫu.
6.2. Khi tiến hành cấy định lượng, có cần đánh giá mẫu đờm trước qua phết nhuộm gram không?
- Cấy định lượng nhằm mục đích là chỉ bắt các vi khuẩn có số lượng lớn trong mẫu đờm vì đây mới chính là tác nhân gây bệnh thật sự. Do vậy về nguyên tắc không nhất thiết phải đánh giá mẫu đờm trước khi cấy định lượng.
- Tuy nhiên vì qui trình cấy định lượng ngoài việc phải dùng bộ thuốc thử làm tan đờm, chúng ta còn phải sử dụng số lượng hộp thạch phân lập nhiều gấp 3 lần phương pháp cấy không định lượng, do vậy rất cần thiết phải đánh giá mẫu đờm để chỉ tìm tiếp tục qui trình cấy định lượng khi mẫu đờm được đánh giá là tin cậy hay tin cậy vừa, nhờ vậy chúng ta có thể tiết kiệm vì không phải tiến hành cấy định lượng mẫu không tin cậy.
6.3. Có khi nào trong kết quả cấy định lượng đờm cho kết quả số lượng vi khuẩn gây bệnh trên 1 000 hay 10000, mà kết quả đánh giá đờm pha phết nhuộm gram quan sát ở quang trường x100 lại không tin cậy không?
- Trên thực tế có phòng thí nghiệm cấy định lượng đờm cho kết quả như trên. Tuy nhiên với nghiên cứu mà chúng tôi đã tiến hành tại phòng thí nghiệm của mình thì 100% các mẫu không tin cậy đều cho kết quả định lượng với số lượng vi khuẩn (ứng với mỗi loại) <1000 CFU/ml.
- Kết quả này càng khẳng định là không nên cấy định lượng khi phết nhuộm gram mẫu đờm quan sát dưới kính hiển vi với quang trường x100 cho thấy có >10 tế bào biểu mô và <25 tế bào bạch cầu.
- Do vậy, có lẽ phòng thí nghiệm này đã quan niệm sai về cách tính số lượng vi khuẩn, thay vì là số lượng của từng loại vi khuẩn, họ lại tính số lượng của tất cả các loại vi khuẩn hiện diện trong mẫu đờm.
6.4. Cấy định lượng đờm có khả thi không với điều kiện hiện nay tại các phòng thí nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh viện?
- Trước đây, khó có thể cấy định lượng đờm vì đòi hỏi phải có thuốc thử làm tan đờm phải đặt mua nước ngoài và giá thành khá đắt. Hiện nay bộ thuốc thử làm tan đờm để cấy định lượng đờm đã được công ty Nam Khoa (đạt ISO 9001:2000) nghiên cứu thành công và sản xuất trong nước với sản phẩm mang tên SPUTAPREP – QT. Sản phẩm này rất tiết kiệm và tiện dụng nhờ được chia nhỏ để có thể thực hiện trên tối thiểu 2 mẫu đờm trong ngày.
- Nếu được trang bị SPUTAPREP – QT; và có thêm các loại môi trường phân lập là MC, BA máu cừu, CA giàu XV (các môi trường này cũng đã được công ty Nam Khoa sản xuất dưới dạng chế sẵn hay sẵn sàng để chế); các phòng thí nghiệm vi sinh lâm sàng bệnh viện hoàn toàn có thể cấy định lượng được mẫu đờm mà không gặp bất cứ khó khăn hay trở ngại gì.
6.5. Khi nào nên chỉ định cấy định lượng đờm?
- Thật ra cấy định lượng đờm có thể chỉ định cho tất cả các trường hợp cấy đờm. Tuy nhiên như đã nói ở trên, cấy định lượng đờm tốm kém gấp 3 lần hơn cấy thông không định lượng. Do vậy, chúng ta không cần thiết cho cấy định lượng đối với các trường hợp viêm phổi cộng đồng nhẹ và vừa.
- Rất cần thiết phải cho cấy định lượng đờm các trường hợp viêm phổi nặng, các trường hợp viêm phổi bệnh viện, các trường hợp viêm phổi nằm tại các phòng cấp cứu và phòng chăm sóc tăng cường (ICU).
- Cũng nên cho cấy định lượng khi quan sát đại thể các mẫu đờm lấy được thấy có lẫn nước bọt.
- Một nguyên tắc mà chúng tôi cho là rất cần thiết phải tuân theo để tiết kiệm chi phí cho bệnh nhân và bệnh việ, đó là không cấy định lượng khi quan sát vi thể mẫu đờm qua phết nhuộm gram cho thấy là mẫu hoàn toàn không tin cậy.