NGUYÊN LÝ CÁC PHÉP ĐO QUANG SỬ DỤNG TRONG XÉT NGHIỆM HÓA SINH

[phuhmtu]

1. Nguyên lý đo quang
1.1. Bản chất của ánh sáng
Ánh sáng là một dạng vật chất vừa có tính chất hạt, vừa có tính chất sóng
Dựa vào tính chất sóng ngưười ta giải thích đưược các hiện tưượng giao thoa, nhiễu xạ và phân cực của ánh sáng.
Dựa vào tính chất hạt của ánh sáng ngưười ta giải thích được hiện tượng quang điện, quang hoá và hiện tưượng hấp thụ ánh sáng. ánh sáng đưược truyền đi trong không gian dưưới dạng các hạt photon mang năng lưượng còn gọi là quang tử
1.2. Sự chuyển động phân tử và các mức năng lưượng của phân tử vật chất
Cấu tạo phân tử của vật chất phức tạp hơn nhiều so với cấu tạo nguyên tử vì vậy chuyển động phân tử cũng rất phức tạp. Chuyển động của phân tử vật chất bao gồm chuyển động của các nguyên tử, chuyển động dao động và chuyển động quay của bản thân phân tử.
Chuyển động của các điện tử trong phân tử tạo thành đám mây điện tử.
Chuyển động dao động là sự thay đổi tuần hoàn vị trí tương đối của các hạt nhân nguyên tử trong phân tử.
Chuyển động quay của phân tử là sự thay đổi tuần hoàn sự định hướng của phân tử trong không gian. Các dạng chuyển động phân tử xảy ra đồng thời và có tương tác lẫn nhau. Mỗi dạng chuyển động phân tử đều có năng lượng đặc trưưng. năng lượng của phân tử gồm 3 dạng năng lượng: năng lượng điện tử, năng lượng dao động và năng lượng quay
1.3. Sự tương tác giữa ánh sáng và các phân tử vật chất (nguyên lý đo quang)
Nguyên lý đo quang: Dựa trên nguyên lý của hiện tượng quang phổ hấp thụ
Quang phổ hấp thụ thực chất là quá trình tương tác giữa hạt photon của ánh sáng với các phần vật chất. Khi ta chiếu một chùm tia sáng gồm các photon có các mức năng lượng khác nhau đi qua một dung dịch chất hấp thụ. Dung dịch chỉ hấp thụ chọn lọc những photon nào có mức năng lượng phù hợp với các mức năng lưượng điện tử, năng lưượng dao động và năng lượng quay của phân tử chất đó.
Nhưư vậy các phân tử vật chất có cấu trúc khác nhau sẽ cho những phổ hấp thụ với các đỉnh và bưước sóng đặc trưưng khác nhau.
1.4. Các định luật về sự hấp thụ ánh sáng.
Định luật Bouger - Lamber: cưường độ của một chùm tia sáng đơn sắc khi đi qua một dung dịch chất hấp thụ tỷ lệ nghịch với chiều dày của lớp dung dịch mà nó đi qua.
Định luật Beer: sự giảm cường độ ánh sáng khi đi qua một dung dịch chất hấp thụ phụ thuộc vào số lượng các tiểu phân tử vật chất hấp thụ mà ánh sáng gặp phải trên đưường đi, nghĩa là phụ thuộc vào nồng độ của dung dịch chất hấp thụ.
Theo định luật Bouguer – Lamber - Bear chỉ đúng với trưường hợp chất cần xác định nồng độ là dung dịch loãng: Độ hấp thụ quang (mật độ quang học) tỷ lệ thuận với nồng độ dung dịch:
DA = . CA.L
Trong đó:
DA : Mật độ quang học của dung dịch
CA : Nồng độ dung dịch
 : Hệ số tắt của dụng dịch
L : Chiều dầy lớp dung dịch mà chùm tia sáng đi qua
Trong các tham số trên, hệ số tắt  của dung dịch không đổi, chiều dầy lớp dung dịch mà chùm tia sáng đi qua không đổi. Bản chất dung dịch và bưước sóng không đổi, nên mật độ quang DA chỉ còn phụ thuộc vào nồng độ CA của dung dịch.
Nếu nồng độ dung dịch cần định lưượng vượt quá giới hạn cho phép thì mật độ quang học không còn tuyến tính với nồng độ dung dịch nưước. Khi đó nồng độ dung dịch tăng, khoảng cách giữa các phân tử là đáng kể, sẽ sai khác đi, hệ số hấp thụ không phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ nữa, khi ấy phải pha loãng dung dịch, kết quả thu đưược phải nhân với tỉ lệ pha loãng.
Quá trình dẫn truyền ánh sáng qua dung dịch đưược biểu diễn như sau:

(Mật độ quang DA chính là hiệu số giữa cường độ ánh sáng tia ló với cường độ ánh sáng tia tới khi đi qua dung dịch ) DA= It - Io
Dựa vào định luật Bouguer - Lamber - Bear ta tính đưược nồng độ dung dịch cần đo:
Trong đó CA mẫu là nồng độ dung dịch mẫu đã biết trưước. DA mẫu là mật độ quang của dung dịch mẫu đo đưược. Nhưư vậy hệ số K đưược coi là hệ số chuẩn trong quá trình làm xét nghiệm tìm nồng độ chất thử:
CA = Hệ số K x DA thử
2. Các phép đo quang (Method ):
2.1. Phép đo điểm cuối (End point ):
Là phép đo mật độ quang (DA) của dung dịch chất thử mà trong quá trình thực hiện phản ứng xảy ra hoàn toàn sau một thời gian nhất định. Tại thời điểm đó phản ứng kết thúc và tạo ra phức hợp màu đặc trưưng và bền vững.
Mật độ đo đưược tỷ lệ thuận với nồng độ

Nồng độ dung dịch thử tuân theo công thức chuẩn :
Hay: C thử = DAThử  Hệ số K ( Factor)
• Chú ý trong phép đo điểm cuối:
- Trong hóa sinh lâm sàng, tất cả các xét nghiệm có phản ứng tạo mẫu đặc trưưng, việc chọn bưước sóng (kính lọc ) phù hợp là việc làm bắt buộc. Hiện nay, hầu hết các xét nghiệm hóa sinh hiện đại, ngưười ta sử dụng các loại thuốc thử với chế phẩm enzym, sản phẩm của phản ứng mầu thường đưược thể hiện dưưới dạng mầu hồng cánh sen, thích hợp cho việc chọn kính lọc có bưước sóng 500 - 546 nm, hoặc dưưới dạng phức hợp mầu xanh lục thích hợp cho việc lựa chọn kính lọc có bưước sóng 578 - 620 nm.
- Riêng kỹ thuật xét nghiệm Bilirubin toàn phần và Bilirubin trực tiếp trong huyết thanh là xét nghiệm sử dụng phép đo điểm cuối nhưưng phải dùng “trắng“ bệnh phẩm (End point with sample blank)
Sở dĩ là nhưư vậy vì bản chất huyết thanh nhiều Bilirubin có mầu vàng, làm thay đổi mật độ quang dung dịch. Mỗi ngưười bệnh có nồng độ Bilirubin khác nhau, nên mỗi bệnh nhân khi làm xét nghiệm Bilirubin máu, đều kèm theo việc xác định MĐQ trắng của bệnh phẩm (Sample blank).
2.2 . Phép đo động học 2 điểm ( Two point kinetic, fixed time )
Phép đo này sử dụng cho các xét nghiệm hóa sinh có phản ứng xảy ra không hoàn toàn sau một thời gian nhất định. Không thể xác định điểm kết thúc của phản ứng.

Tại thời điểm t1 , đo mật độ quang D1ư
Tại thời điểm t2 , đo mật độ quang D2ư
Hiệu số mật độ quang D = D2 - D1
Nồng độ chất cần tìm được xác định theo công thức sau:

Trong hóa sinh lâm sàng, xét nghiệm Ure và Creatinin máu thường được sử dụng phép đo động học 2 điểm.
2.3 . Phép đo động học enzym ( enzymatic kinetic )
Phép đo này sử dụng cho các xét nghiệm hóa sinh tìm hoạt độ các enzym trong huyết thanh.
Phản ứng enzym thường không tạo phức hợp mầu mà làm thay đổi độ đục của dung dịch phản ứng trong khoảng thời gian nhất định. Việc xác định hoạt độ của enzym không thể xác định bằng phép đo điểm cuối mà phải sử dụng phép đo động học ở nhiều thời điểm ( t1, t2, t3, ..., tn )

Người ta thường quen gọi đó là phép đo Kinetic
Phép đo này tính hoạt độ enzym phải thông qua việc xác định hiệu số mật độ quang trung bình:
D.
D1 = D2 - D1
D2 = D3 - D2
D3 = D4 - D3 
D4 = D5 - D4
Hoạt độ enzym : U/l = D x K ( Hệ số K do nhà sản xuất hoá chất cung cấp).

[hung ho]

hệ số factor do nhà sản xuất hoá chất cuung cấp nhưng sao khi calip thì hệ số factor no lệch nhiều so với nsx vậy?

[duongduchoa]

Hệ số factor lệch so với nhà sản xuất là chuyện bình thường, vị hệ số foctor còn phụ thuộc vào chỉ số của bóng đèn, nếu bóng đèn già thì cũng thay đổi kết quả. Một số hóa chất của một số hãng không có hệ số foctor mà ta phải tự đo ống chuẩn để lấy hệ số foctor.

[MinhDuyTran]

Cho e hỏi: trong phương pháp đo động học enzyme có 2 phương pháp là đo sản phẩm được tạo ra và đo lượng cơ chất bị mất đi. Vậy những xét nghiệm nào thuộc dạng đo cơ chất, xét nghiệm nào cho sản phẩm vậy?
VD: Amylase, AST, ALP, GGT...

[NGOC CHAU]

Sao hình không xem được vậy^^?