06-30-2014, 03:35 PM
(Sửa đổi lần cuối: 06-30-2014, 03:36 PM bởi tu_hoa_luong.)
Phế cầu khuẩn (Streptococcus pneumoniae) là một thành viên thường trực của hệ vi khuẩn vùng hầu họng, tuy nhiên tỷ lệ người lành mang phế cầu thay đổi tuỳ theo tuổi, môi trường sống, mùa và sự có mặt của nhiễm trùng đường hô hấp trên (tỷ lệ trung bình dao động từ 25-70% dân số). Phế cầu là căn nguyên hàng đầu của “viêm phổi mắc phải ở cộng đồng” (viêm phổi thùy và tiểu thùy, xấp xỉ 500.000 trường hợp viêm phổi xảy ra hàng năm ở tất cả các lứa tuổi tại Mỹ. Theo số liệu điều tra của một số nghiên cứu tại Việt nam thời gian 1990 – 2003 cho thấy 40-70% trẻ khoẻ mạnh mang phế cầu vùng hầu họng và 26-83% các trường hợp viêm đường hô hấp cấp tính có nguyên nhân là phế cầu).
Phế cầu là căn nguyên chủ yếu của viêm tai giữa, viêm xoang ở trẻ em và là căn nguyên phổ biến nhất của viêm màng não ở người lớn. Từ khi có kháng sinh, tỷ lệ chết của tất cả các bệnh phế cầu đã giảm từ 30% xuống 15% nhưng tỷ lệ này lại lên đến 70% ở những bệnh nhân 70 tuổi hoặc già hơn, mặc dù đã được điều trị.
1. Vai trò gây bệnh và tính chất kháng nguyên
Phế cầu khuẩn có thể gây viêm mũi-họng (nasopharyngitis), viêm tai giữa, viêm xoang. Viêm phổi thùy (thường xảy ra ở người 30-50 tuổi), viêm tiểu thùy phổi (thường xảy ra ở trẻ em, người lớn > 50 tuổi), viêm phế quản-phổi, nhiễm khuẩn huyết dẫn tới viêm màng não, viêm nội tâm mạc, viêm ngoại tâm mạc, hoặc gây apxe ở nhiều tổ chức khác trong cơ thể.
Cơ chế gây bệnh:
* Vỏ polysaccarit là yếu tố bảo vệ vi khuẩn tránh được sự thực bào từ các đại thực bào – là yếu tố quan trọng giúp vi khuẩn tồn tại và phát triển để gây bệnh.
* Pneumolysin là chất phá huỷ tế bào nội mô phổi, phá vỡ hàng rào nội mô ngăn cách phế nang và máu do đó phế cầu có thể tràn từ các phế nang vào máu (là nguyên nhân dẫn tới các triệu chứng nặng như khởi phát đột ngột rầm rộ, phù quink não, đông máu nội mạch rải rác...)
* Protêin A trên bề mặt tế bào vi khuẩn giúp phế cầu bám dính vào tế bào biểu mô phế quản, tạo điều kiện cho sự xâm lấn sâu hơn xuống đường hô hấp dưới.
* Enzym (men) phân huỷ IgA (sIga protease) giúp phế cầu tồn tại được ở hầu họng.
* Phản ứng viêm cấp tính mạnh gây nên do các thành phần của cấu trúc thành tế bào vi khuẩn gây nên (peptidoglycan, axit teichoic... có khả năng kích thích phản ứng viêm mạnh mẽ)
Cấu trúc kháng nguyên liên quan tới phân loại và độc lực: Vỏ polysaccharide là cơ sở duy nhất cho sự phân loại và là yếu tố độc lực duy nhất được biết. Có 90 týp huyết thanh phế cầu khuẩn (pneumococci) đã được nhận biết. Phế cầu týp 23 gây bệnh phổ biến nhất. Vỏ của phế cầu là yếu tố độc lực quan trọng và có tính quyết định trong bệnh sinh. Vỏ ức chế sự thực bào, tạo điều kiện cho vi khuẩn tồn tại, nhân lên trong tổ chức vật chủ và sinh bệnh. Vỏ kích thích tạo kháng thể đặc hiệu loài, có tính bảo vệ vật chủ thông qua việc tăng khả năng thực bào, giết vi khuẩn ngay ở trong tế bào bởi các bạch cầu đa nhân.
Phức hợp polysaccharide vỏ phế cầu có thành phần là: glucose, 2-acetamido-2, 4, 6-trideoxy galactose, galactosamine, ribitolphosphate và cholinphosphate.
2. Đường lây truyền
Người lành mang vi khuẩn:
* Trẻ nhỏ < 5 tuổi: 60% trẻ khoẻ mạnh có phế cầu (từ 1 týp huyết thanh đến vài týp huyết thanh) vùng hầu họng
* Người lớn: 10-30% mang vi khuẩn phế cầu vùng họng
Ngoại sinh: chủ yếu lây từ những người đang có bệnh hay người lành mang vi khuẩn sang những người nhạy cảm mà có sức đề kháng với phế cầu đang bị giảm vì nhiễm virut, dị ứng, suy dinh dưỡng, nghiện rượu, suy nhược nói chung. Bệnh nhân cắt lách hoặc thiếu máu hồng cầu hình liềm là những người nhạy cảm đặc biệt với các bệnh do phế cầu.
Nội sinh: từ một người lành mang vi khuẩn vùng mũi-họng chuyển thành người bệnh do sức đề kháng giảm bởi các yếu tố được nêu ở trên.
3. Tính miễn dịch trong trường hợp tái nhiễm
Là tính miễn dịch đặc hiệu loài và vững bền. Hiện nay đã có vắc xin phế cầu chế tạo từ 23 loại kháng nguyên vỏ quyết định và được áp dụng ở các nước từ nhiều năm nay.
4. Hình thể và tính chất nuôi cấy
S.pneumoniae (phế cầu khuẩn) là 1 loại cầu khuẩn thường đứng thành đôi hình mắt kính hay hình ngọn nến, nên còn được gọi là song cầu, bắt màu Gram dương, có vỏ và không di động. Ở môi trường lỏng hay trong các tổ chức bệnh phẩm có thể xếp thành chuỗi ngắn và hãn hữu có thể đứng riêng rẽ một mình, thường ở trong điều kiện và môi trường kém dinh dưỡng hoặc có nồng độ ion Mg++thấp. Hầu hết phế cầu khuẩnbắt màu Gram dương song đôi khi trong quá trình thay đổi nuôi cấy có thể trở thành Gram âm, do vi khuẩn bị tự ly giải hoặc do các hoạt tính bề mặt bị tác động bởi muối mật (sodium deoxycholate hoặc sodium dodecylsulfat). Trong môi trường lỏng phế cầu khuẩn mọc có khuynh hướng khuyếch tán và lắng cặn khi môi trường đã ngả sang axit. Trên môi trường thạch (thạch máu cừu hay thỏ), vi khuẩn có khuẩn lạc tròn bóng ướt do có vỏ, không sắc tố, có khuynh hướng lõm ở giữa vì sự hoạt động của một enzym tự ly giải, đường kính khuẩn lạc 0,5-1,5mm, xung quanh khuẩn lạc có quầng tan huyết alpha.
Phế cầu khuẩn phát triển tốt trong các môi trường lỏng và trên các môi trường thạch Tryptocasein soya có bổ xung 5% máu (cừu, ngựa, thỏ) đã lấy hết tơ huyết. Không nên dùng máu người vì thường có chất kháng sinh và các chất ức chế vi khuẩn phát triển. Phế cầu phát triển tốt trong khí trường có 5% CO2 ở 37OC, nếu không có tủ ấm CO2 có thể dùng chuông thủy tinh kín và đốt nến, với cách này cũng tạo được khí trường có CO2 nhưng chỉ dưới 5% và vi khuẩn vẫn phát triển được.
5. Kỹ thuật xác định phế cầu trong phòng thí nghiệm
5. 1. Xét nghiệm trực tiếp:
a/ Nhuộm Gram: nói chung, theo phương pháp thông thường, xét nghiệm trực tiếp các bệnh phẩm từ họng, mũi thường ít giá trị trong việc xác định căn nguyên gây bệnh vì lẫn nhiều loại vi khuẩn và cũng có thể đó chỉ là các vi khuẩn chí, chỉ các tiêu bản của các bệnh phẩm là máu, dịch não tủy hay các dịch cơ thể mới có giá trị trong chẩn đoán căn nguyên phế cầu. Nhuộm Gram tiêu bản đờm cũng có giá trị xác định căn nguyên phế cầu khi số lượng bạch cầu đa nhân tăng lên. Phế cầu thường xếp đôi hình mắt kính hay ngọn nến, cũng có thể đứng đơn lẻ, tạo chuỗi ngắn, bắt màu Gram dương. Tính bắt màu Gram dương có thể bị mất do bệnh phẩm để quá lâu, môi trường không đủ chất dinh dưỡng hay bệnh nhân đã dùng nhiều kháng sinh.
b/ Thử nghiệm Quellung”: phản ứng Quellung dương tính xảy ra khi kháng thể đặc hiệu loài (type-specific antiserum) gắn với thành phần polysaccharide của vỏ phế cầu, gây nên sự thay đổi chỉ số khúc xạ của vỏ khi ánh sáng chiếu vào mà ta nhìn thấy dễ dàng dưới dạng “phình vỏ”. Hình ảnh quan sát thấy là: tế bào vi khuẩn bắt màu xanh đen, xung quanh tế bào có một quầng với đường viền sắc nét, đó là gờ ngoài của vỏ (do ánh sáng xuyên qua vỏ sáng hơn vùng tế bào phế cầu). Các tế bào đơn, xếp đôi, chuỗi ngắn hay đám đều có thể có phản ứng Quellung. Bằng thử nghiệm này, phế cầu khuẩn có thể được xác định trực tiếp từ các dịch cơ thể (dịch não tuỷ, dịch phúc mạc, dịch hút nội khí quản hoặc đờm) hay từ 1 khuẩn lạc đơn. Kỹ thuật được thực hiện như sau: đặt một giọt nhỏ hay 1 ăng (1-2mm) dịch cơ thể, canh thang nuôi cấy hay huyền dịch vi khuẩn (khuẩn lạc của nuôi cấy 18-24 giờ ở 35-370C/ 5% CO2, pha trong nước muối sinh lý tạo độ đục tương đương 0,5 Mc Farland) lên phiến kính sạch. Nhỏ tiếp 1 giọt (khoảng 30μl) hay 1 ăng đầy (1-2 mm) kháng huyết thanh, trộn kỹ. Nhỏ tiếp 1 ăng đầy (1-2mm) dung dịch xanh methylene bão hoà, trộn kỹ. Phủ lamen lên hỗn hợp trên, sau 10 phút, quan sát hiện tượng phình vỏ của phế cầu bởi tác động của kháng huyết thanh đặc hiệu bằng kính hiển vi với vật kính dầu.
Chú ý: phản ứng chỉ xảy ra khi có sự tương quan về lượng giữa kháng nguyên (vi khuẩn) và kháng thể (kháng huyết thanh), do đó để tránh âm tính giả do dư thừa kháng nguyên, nên chuẩn bị các phiến kính sao cho mỗi một vi trường chỉ chứa từ 50-100 tế bào, lượng tế bào tối ưu nhất để quan sát là 25-50 tế bào vi khuẩn trong một vi trường.
Trong thử nghiệm Quellung, phế cầu khuẩn được xác định với một bộ kháng huyết thanh. Kháng huyết thanh có thể là một tập hợp của 90 loại kháng thể đặc hiệu tương ứng với 90 loại phế cầu khuẩn khác nhau (omniserum) còn gọi là kháng huyết thanh đa giá, hoặc tập hợp của một số kháng thể đặc hiệu loài hay nhóm và trong mỗi tập hợp có 4-7 loại kháng huyết thanh đơn giá (58 loại trong tổng số 90 thuộc về 20 nhóm kháng huyết thanh mà mỗi nhóm bao gồm từ 2-4 loại). Hiện nay người ta đã biết rõ 46 loại hay nhóm phế cầu khuẩn khác nhau và hơn 90% các chủng phế cầu phân lập được từ máu hay dịch não tuỷ đều thuộc về 1 trong 23 loại hay nhóm phế cầu khác nhau mà đã được chọn để sản xuất vắc xin phòng bệnh do phế cầu. Do vậy, tại một số phòng thí nghiệm người ta thường dùng 12 nhóm kháng huyết thanh (12 pooled sera) để xác định loại hay nhóm các chủng phế cầu phân lập được từ máu và dịch não tuỷ. Khi xác định týp huyết thanh hay thực hiện thử nghiệm Quellung nên tuân theo hướng dẫn của hãng sản xuất và theo mục đích dịch tễ học để chọn kháng huyết thanh. Có thể có mặt các kháng thể gây phản ứng chéo trong omniserum nên phải có sự kiểm tra hình thái học của khuẩn lạc và vi khuẩn cũng như tính bắt màu Gram của các chủng được thử nghiệm.
5.2. Nuôi cấy phân lập:
5.2.1. Cách lấy bệnh phẩm:
a/ Chất dịch đường hô hấp: trong những trường hợp viêm phổi, viêm phế quản, viêm phế quản phổi...
* Đờm: nếu là người lớn, đờm được lấy vào buổi sáng sớm, ho và khạc sâu, đờm được giữ ở hộp vô khuẩn rồi chuyển về phòng thí nghiệm trong vòng vài giờ.
* Dịch tỵ hầu (mũi-họng): nếu bệnh nhân không khạc được hoặc là trẻ nhỏ dùng tăm bông cán mảnh mềm lấy chất dịch ở ngã ba mũi - họng theo đường mũi (dịch tỵ hầu): đưa tăm bông vào sâu bằng một nửa khoảng cách tính từ cánh mũi đến dái tai cùng phía, vê nhẹ rồi rút ra. Chú ý, nếu chưa vào đủ độ sâu đã có vật cản không cố lấy mà phải làm lại ở mũi bên kia. Tăm bông phải đảm bảo không dễ bị tụt đầu bông vào khí quản và cán làm bằng kim loại mềm không gỉ không dễ gẫy khi thực hiện thao tác.
* Chất dịch hô hấp lấy bằng máy hút chân không nhẹ: cách này thay thế cho cách ngoáy tỵ hầu ở trên. Dùng ống thông plastic nhỏ mềm đưa sâu qua lỗ mũi một khoảng cách bằng khoảng cách từ đỉnh mũi đến ống tai ngoài của bệnh nhân để hút dịch.
* Ngoáy họng: đè lưỡi, dùng tăm bông vô khuẩn đã được làm ẩm bằng nước muối sinh lý (vô khuẩn) chà sát nhẹ 2 hốc amidan, thành sau họng (sau lưỡi gà). Tránh không được chạm vào lưỡi, răng, mặt trong má và lưỡi gà. Sau đó phải cắm tăm bông vào môi trường vận chuyển.
b/ Dịch não tuỷ: trong trường hợp nghi viêm màng não, dùng kim chọc tủy sống vô khuẩn lấy khoảng 2-3ml nước não tủy.
c/ Máu: trong trường hợp bệnh nhân có sốt cao, nghi viêm màng não, viêm phổi cấp, dùng bơm kim tiêm vô khuẩn lấy ít nhất 3ml máu tĩnh mạch cho ngay vào bình canh thang não-tim (brain-heart infusion) hay thioglycolate theo tỷ lệ 1 phần máu 10 phần canh thang, hoặc sử dụng chai cấy máu do các hãng thương mại pha chế sẵn. Chú ý: động tác và quá trình lấy máu, cấy máu phải đảm bảo thật vô khuẩn trong một quy trình kín. Tốt nhất, kim lấy máu được nối trực tiếp vào bình môi trường qua một ống cao su hay plastic vô khuẩn. Sát trùng vị trí lấy máu bằng cồn Iốt.
Phế cầu khuẩn cũng là một vi khuẩn rất nhạy cảm và dễ chết, vì vậy tốt nhất các bệnh phẩm nên được chuyển về phòng thí nghiệm trong vòng 2 giờ, hoặc không quá 6 giờ và có thể giữ ở nhiệt độ 4-8oC không quá 24h. Nếu quá trình luân chuyển từ 2-4 giờ bệnh phẩm có thể được cấy ngay hoặc tăng sinh trước trong canh thang (tryptocasein soya hoặc canh thang não tim) 2 giờ ở 37oC. Nếu thời gian chuyển bệnh phẩm từ 4-8 giờ, bệnh phẩm nên được ủ trong canh thang ít nhất là 2 giờ rồi mới cấy ra thạch máu 5%.
d/ Các bệnh phẩm khác: mủ amiđan, mủ tai giữa, dịch chọc phổi
5.2.2 Quy trình phân lập:
a/ Trực tiếp:nhuộm Gram quan sát hình thể và đánh giá số lượng các tế bào viêm (bạch cầu đa nhân trung tính, đại thực bào) và vi khuẩn ở trong và ngoài tế bào theo +, ++, +++
Đếm tế bào: nếu trên 25 bạch cầu đa nhân và dưới 25 tế bào biểu mô (trên tổng số 100 tế bào ở vi trường) có nhiều khả năng do nhiễm vi khuẩn. Nếu là đờm nên thuần nhất đờm trong 1-2ml nước muối sinh lý và dùng máy khuấy làm lỏng đờm trước khi dàn tiêu bản
b/ Nuôi cấy và phân lập: tùy theo từng loại bệnh phẩm để có các cách xử lý và nuôi cấy phù hợp.
* Bệnh phẩm đường hô hấp: nếu đặc cần làm lỏng đờm hoặc dịch đường hô hấp bằng N-Acetyl-L-Cystine hoặc sputolysin (có tác dụng giải phóng vi khuẩn khỏi các khối đặc của đờm và tế bào). Nên pha loãng bệnh phẩm ít nhất 10 lần trong nước muối sinh lý trước khi cấy, tốt nhất nên áp dụng phương pháp cấy đếm.
* Dịch não tủy: nên cấy song song vào thạch máu 5% (Tryptocasein soya hoặc thạch não tim có bổ xung 5% máu đã lấy hết sợi tơ huyết) và canh thang có bổ sung 5% máu (thỏ, ngựa, cừu) nhằm mục đích tăng sinh cho vi khuẩn, ủ 370C / 5% CO2, phải cấy chuyển từ canh thang tăng sinh ra thạch máu các ngày thứ 2, 3 và 7 trong trường hợp đĩa thạch máu cấy trực tiếp bệnh phẩm âm tính. Để có thể phân lập được cả loại vi khuẩn khó tính như H. influenzae, có thể cấy bệnh phẩm lên thạch sôcôla hoặc sử dụng thạch máu thỏ tươi 7% (ngoài phế cầu khuẩn và một số loại vi khuẩn khác, thạch máu thỏ tươi 7% có khả năng phân lập được cả H. influenzae)
* Máu: trong trường hợp có sốt hoặc nghi nhiễm khuẩn huyết, cấy máu theo một chu trình kín vô khuẩn (lấy 3-5ml máu tĩnh mạch cấy vào canh thang não-tim (brain-heart infusion) hay canh thang thioglycolate theo tỷ lệ 1 phần máu 10 phần canh thang hoặc cho vào chai cấy máu do các hãng sản xuất sẵn), sau đó ủ ở 370C/ 5% CO2 / 18-24 giờ. Nếu dương tính cấy chuyển sang các môi trường thạch (thạch máu 5%, thạch sôcôla).
Một số môi trường nuôi cấy phát hiện phế cầu khuẩn:
- Thạch máu 5% có Gentamycin [5μg/ml]: chỉ cho phế cầu phát triển.
- Thạch máu 5% không có Gentamycin: tìm phế cầu, liên cầu, tụ cầu và một số trực khuẩn Gram âm
- Thạch máu thỏ 7% phát hiện cả phế cầu và H.influenzae
Ủ ấm trong khí trường 370 C có 5% CO2 từ 18 - 24 giờ. Nếu không có tủ ấm CO2, đặt các hộp lồng vào chuông thủy tinh kín và đốt 1 ngọn nến, khi nến tắt cũng tạo được khí trường có CO2, sau đó đặt chuông vào tủ ấm 370 C.
Sau 18-24 giờ, quan sát trên môi trường thạch máu thấy các khuẩn lạc của phế cầu khuẩn nhỏ 0,5-1,5mm, có vỏ: nhày ướt, có xu hướng lõm giữa, có quầng tan huyết màu xanh (kiểu tan huyết alpha). Cấy thuần lại trên một đĩa thạch máu khác, ủ ấm 370C/5% CO2/18 giờ, ngày tiếp theo làm thêm các thử nghiệm sau để khẳng định (nếu chỉ thấy thuần một loại khuẩn lạc thì không cần cấy thuần mà có thể làm luôn các bước khẳng định).
c/ Các thử nghiệm xác định:
Thử nghiệm Optochin (nhạy cảm với optochin):
Cấy dày lên một đĩa thạch máu 5% vi khuẩn nghi ngờ là phế cầu, sau đó đặt khoanh giấy optochin d=6mm (chứa 5μg chất ethylhydrocupreine) lên, ủ 35-37OC/5% CO2, Sau 18-24 giờ nếu xung quanh khoanh giấy không có vòng vô khuẩn có nghĩa đó chỉ là Viridans streptococci. Nếu có vòng vô khuẩn có đường kính ≥ 14mm là dương tính (phế cầu). Nếu vòng vô khuẩn từ 9-13mm phải làm thêm thử nghiệm tan trong muối mật.
Thử nghiệm tan trong muối mật (Bile solubility):
1/ Từ nuôi cấy thuần và mới (18-24 giờ), tạo 0,5 ml canh khuẩn trong nước muối sinh lý tương đương độ đục 0,5 Mc Farland.
2/ Chia đôi canh khuẩn vào 2 ống nghiệm (0,25ml/1 ống), sau đó cho tiếp vào 1 ống canh khuẩn 0,25ml NaCl 0,9%, ống kia cho 0,25ml muối mật 2% (deoxycholate), lắc nhẹ, ủ 35-370C/ 2 giờ.
3/ Theo dõi sự ly giải tế bào vi khuẩn trong ống có muối mật sau 2 giờ ủ, nếu ống có muối mật trở nên trong, hết đục là dương tính.
Nếu thực hiện trực tiếp thử nghiệm tan trong muối mật với khuẩn lạc nghi ngờ ở trên thạch máu, phải sử dụng dung dịch sodium deoxycholate 10%, đọc kết quả sau 15-20 phút nếu là phế cầu khuẩn, khuẩn lạc sẽ biến mất hoặc dẹt hẳn xuống do bị ly giải, trong khi khuẩn lạc liên cầu không bị muối mật tác động.
Thử nghiệm ngưng kết trên phiến kính:
Dựa trên nguyên lý của phản ứng kết hợp kháng nguyên vỏ của phế cầu với kháng thể đặc hiệu tương ứng tạo sự ngưng kết. Trên thị trường thương mại các sinh phẩm sử dụng cho thử nghiệm ngưng kết trên phiến luôn có sẵn, giúp cho việc xác định các khuẩn lạc nghi ngờ có phải là phế cầu hay không. Ví dụ, bộ kit Slidex Pneumo của Vitek Systems Inc. hay Pneumoslide của BBL Microbiology Systems, Cockeysville, MD. Phải thực hiện theo đúng hướng dẫn của Nhà sản xuất.
d/ Chẩn đoán huyết thanh học:
Hiện nay đã xác định được 90 týp huyết thanh của các chủng phế cầu có vỏ gây bệnh. Người ta đã xếp thành 9 nhóm kháng huyết thanh đa giá, được ghi theo thứ tự bằng chữ cái in hoa từ A đến I, mỗi nhóm có từ 4-7 kháng huyết thanh đơn giá đặc hiệu.
* Thử nghiệm Quellung (như trên): xác định được týp huyết thanh của phế cầu (theo nhóm, hoặc theo týp đơn)
* Phương pháp định týp huyết thanh: qua các bước
· Nuôi cấy phân lập, thuần nhất vi khuẩn
· Thử nghiệm optochin dương tính
· Tạo huyền dịch vi khuẩn trong nước muối sinh lý (0,5 Mc Farland) hay canh khuẩn trong canh thang BHI có 5% máu (ủ 35-370C/5% CO2/ 4-8 giờ)
· Có thể bất hoạt vi khuẩn bằng nhỏ vài giọt Formalin vào canh khuẩn trước khi làm phản ứng với kháng huyết thanh
· Lấy một phiến kính sạch, đặt lên 1 ăng (1-2mm) kháng huyết thanh đa giá, sau đó đặt 1 ăng canh khuẩn đã bất hoạt bằng Formalin (1-2mm đường kính), trộn đều, rồi lấy 1 lá kính mỏng (lamen) đậy lên.
· Quan sát dưới kính hiển vi với thị kính X10 và vật kính X40, điều chỉnh ánh sáng để thấy rõ hiện tượng "phình" của vỏ phế cầu bởi kháng huyết thanh.
· Khi đã có dương tính với kháng huyết thanh đa giá, thử lần lượt với các kháng huyết thanh đơn giá trong nhóm để xác định týp huyết thanh của chủng phế cầu được thử.
6. Tiêu chuẩn xác định phế cầu
- Hình thể khuẩn lạc trên môi trường thạch máu 5% (có hay không có gentamycin): nhỏ, ướt, có xu hướng lõm giữa, tan huyết alpha.
- Tính chất vi khuẩn: Song cầu hình ngọn nến hay cặp mắt kính, bắt màu Gram dương (cũng có thể đứng đơn hay tạo chuỗi ngắn) nhưng phải:
- Nhạy cảm optochin: đường kính vòng vô khuẩn ≥14mm
- Hoặc: ít nhạy cảm với optochin (đường kính vòng vô khuẩn từ 9-13mm) nhưng tan trong muối mật, cũng kết luận là phế cầu khuẩn.
Không phải là phế cầu khuẩn khi:
- Không nhạy cảm với optochin
- Hoặc có vùng ức chế phát triển bởi optochin với đường kính nhỏ hơn 14mm nhưng không tan trong muối mật.
Phế cầu là căn nguyên chủ yếu của viêm tai giữa, viêm xoang ở trẻ em và là căn nguyên phổ biến nhất của viêm màng não ở người lớn. Từ khi có kháng sinh, tỷ lệ chết của tất cả các bệnh phế cầu đã giảm từ 30% xuống 15% nhưng tỷ lệ này lại lên đến 70% ở những bệnh nhân 70 tuổi hoặc già hơn, mặc dù đã được điều trị.
1. Vai trò gây bệnh và tính chất kháng nguyên
Phế cầu khuẩn có thể gây viêm mũi-họng (nasopharyngitis), viêm tai giữa, viêm xoang. Viêm phổi thùy (thường xảy ra ở người 30-50 tuổi), viêm tiểu thùy phổi (thường xảy ra ở trẻ em, người lớn > 50 tuổi), viêm phế quản-phổi, nhiễm khuẩn huyết dẫn tới viêm màng não, viêm nội tâm mạc, viêm ngoại tâm mạc, hoặc gây apxe ở nhiều tổ chức khác trong cơ thể.
Cơ chế gây bệnh:
* Vỏ polysaccarit là yếu tố bảo vệ vi khuẩn tránh được sự thực bào từ các đại thực bào – là yếu tố quan trọng giúp vi khuẩn tồn tại và phát triển để gây bệnh.
* Pneumolysin là chất phá huỷ tế bào nội mô phổi, phá vỡ hàng rào nội mô ngăn cách phế nang và máu do đó phế cầu có thể tràn từ các phế nang vào máu (là nguyên nhân dẫn tới các triệu chứng nặng như khởi phát đột ngột rầm rộ, phù quink não, đông máu nội mạch rải rác...)
* Protêin A trên bề mặt tế bào vi khuẩn giúp phế cầu bám dính vào tế bào biểu mô phế quản, tạo điều kiện cho sự xâm lấn sâu hơn xuống đường hô hấp dưới.
* Enzym (men) phân huỷ IgA (sIga protease) giúp phế cầu tồn tại được ở hầu họng.
* Phản ứng viêm cấp tính mạnh gây nên do các thành phần của cấu trúc thành tế bào vi khuẩn gây nên (peptidoglycan, axit teichoic... có khả năng kích thích phản ứng viêm mạnh mẽ)
Cấu trúc kháng nguyên liên quan tới phân loại và độc lực: Vỏ polysaccharide là cơ sở duy nhất cho sự phân loại và là yếu tố độc lực duy nhất được biết. Có 90 týp huyết thanh phế cầu khuẩn (pneumococci) đã được nhận biết. Phế cầu týp 23 gây bệnh phổ biến nhất. Vỏ của phế cầu là yếu tố độc lực quan trọng và có tính quyết định trong bệnh sinh. Vỏ ức chế sự thực bào, tạo điều kiện cho vi khuẩn tồn tại, nhân lên trong tổ chức vật chủ và sinh bệnh. Vỏ kích thích tạo kháng thể đặc hiệu loài, có tính bảo vệ vật chủ thông qua việc tăng khả năng thực bào, giết vi khuẩn ngay ở trong tế bào bởi các bạch cầu đa nhân.
Phức hợp polysaccharide vỏ phế cầu có thành phần là: glucose, 2-acetamido-2, 4, 6-trideoxy galactose, galactosamine, ribitolphosphate và cholinphosphate.
2. Đường lây truyền
Người lành mang vi khuẩn:
* Trẻ nhỏ < 5 tuổi: 60% trẻ khoẻ mạnh có phế cầu (từ 1 týp huyết thanh đến vài týp huyết thanh) vùng hầu họng
* Người lớn: 10-30% mang vi khuẩn phế cầu vùng họng
Ngoại sinh: chủ yếu lây từ những người đang có bệnh hay người lành mang vi khuẩn sang những người nhạy cảm mà có sức đề kháng với phế cầu đang bị giảm vì nhiễm virut, dị ứng, suy dinh dưỡng, nghiện rượu, suy nhược nói chung. Bệnh nhân cắt lách hoặc thiếu máu hồng cầu hình liềm là những người nhạy cảm đặc biệt với các bệnh do phế cầu.
Nội sinh: từ một người lành mang vi khuẩn vùng mũi-họng chuyển thành người bệnh do sức đề kháng giảm bởi các yếu tố được nêu ở trên.
3. Tính miễn dịch trong trường hợp tái nhiễm
Là tính miễn dịch đặc hiệu loài và vững bền. Hiện nay đã có vắc xin phế cầu chế tạo từ 23 loại kháng nguyên vỏ quyết định và được áp dụng ở các nước từ nhiều năm nay.
4. Hình thể và tính chất nuôi cấy
S.pneumoniae (phế cầu khuẩn) là 1 loại cầu khuẩn thường đứng thành đôi hình mắt kính hay hình ngọn nến, nên còn được gọi là song cầu, bắt màu Gram dương, có vỏ và không di động. Ở môi trường lỏng hay trong các tổ chức bệnh phẩm có thể xếp thành chuỗi ngắn và hãn hữu có thể đứng riêng rẽ một mình, thường ở trong điều kiện và môi trường kém dinh dưỡng hoặc có nồng độ ion Mg++thấp. Hầu hết phế cầu khuẩnbắt màu Gram dương song đôi khi trong quá trình thay đổi nuôi cấy có thể trở thành Gram âm, do vi khuẩn bị tự ly giải hoặc do các hoạt tính bề mặt bị tác động bởi muối mật (sodium deoxycholate hoặc sodium dodecylsulfat). Trong môi trường lỏng phế cầu khuẩn mọc có khuynh hướng khuyếch tán và lắng cặn khi môi trường đã ngả sang axit. Trên môi trường thạch (thạch máu cừu hay thỏ), vi khuẩn có khuẩn lạc tròn bóng ướt do có vỏ, không sắc tố, có khuynh hướng lõm ở giữa vì sự hoạt động của một enzym tự ly giải, đường kính khuẩn lạc 0,5-1,5mm, xung quanh khuẩn lạc có quầng tan huyết alpha.
Phế cầu khuẩn phát triển tốt trong các môi trường lỏng và trên các môi trường thạch Tryptocasein soya có bổ xung 5% máu (cừu, ngựa, thỏ) đã lấy hết tơ huyết. Không nên dùng máu người vì thường có chất kháng sinh và các chất ức chế vi khuẩn phát triển. Phế cầu phát triển tốt trong khí trường có 5% CO2 ở 37OC, nếu không có tủ ấm CO2 có thể dùng chuông thủy tinh kín và đốt nến, với cách này cũng tạo được khí trường có CO2 nhưng chỉ dưới 5% và vi khuẩn vẫn phát triển được.
5. Kỹ thuật xác định phế cầu trong phòng thí nghiệm
5. 1. Xét nghiệm trực tiếp:
a/ Nhuộm Gram: nói chung, theo phương pháp thông thường, xét nghiệm trực tiếp các bệnh phẩm từ họng, mũi thường ít giá trị trong việc xác định căn nguyên gây bệnh vì lẫn nhiều loại vi khuẩn và cũng có thể đó chỉ là các vi khuẩn chí, chỉ các tiêu bản của các bệnh phẩm là máu, dịch não tủy hay các dịch cơ thể mới có giá trị trong chẩn đoán căn nguyên phế cầu. Nhuộm Gram tiêu bản đờm cũng có giá trị xác định căn nguyên phế cầu khi số lượng bạch cầu đa nhân tăng lên. Phế cầu thường xếp đôi hình mắt kính hay ngọn nến, cũng có thể đứng đơn lẻ, tạo chuỗi ngắn, bắt màu Gram dương. Tính bắt màu Gram dương có thể bị mất do bệnh phẩm để quá lâu, môi trường không đủ chất dinh dưỡng hay bệnh nhân đã dùng nhiều kháng sinh.
b/ Thử nghiệm Quellung”: phản ứng Quellung dương tính xảy ra khi kháng thể đặc hiệu loài (type-specific antiserum) gắn với thành phần polysaccharide của vỏ phế cầu, gây nên sự thay đổi chỉ số khúc xạ của vỏ khi ánh sáng chiếu vào mà ta nhìn thấy dễ dàng dưới dạng “phình vỏ”. Hình ảnh quan sát thấy là: tế bào vi khuẩn bắt màu xanh đen, xung quanh tế bào có một quầng với đường viền sắc nét, đó là gờ ngoài của vỏ (do ánh sáng xuyên qua vỏ sáng hơn vùng tế bào phế cầu). Các tế bào đơn, xếp đôi, chuỗi ngắn hay đám đều có thể có phản ứng Quellung. Bằng thử nghiệm này, phế cầu khuẩn có thể được xác định trực tiếp từ các dịch cơ thể (dịch não tuỷ, dịch phúc mạc, dịch hút nội khí quản hoặc đờm) hay từ 1 khuẩn lạc đơn. Kỹ thuật được thực hiện như sau: đặt một giọt nhỏ hay 1 ăng (1-2mm) dịch cơ thể, canh thang nuôi cấy hay huyền dịch vi khuẩn (khuẩn lạc của nuôi cấy 18-24 giờ ở 35-370C/ 5% CO2, pha trong nước muối sinh lý tạo độ đục tương đương 0,5 Mc Farland) lên phiến kính sạch. Nhỏ tiếp 1 giọt (khoảng 30μl) hay 1 ăng đầy (1-2 mm) kháng huyết thanh, trộn kỹ. Nhỏ tiếp 1 ăng đầy (1-2mm) dung dịch xanh methylene bão hoà, trộn kỹ. Phủ lamen lên hỗn hợp trên, sau 10 phút, quan sát hiện tượng phình vỏ của phế cầu bởi tác động của kháng huyết thanh đặc hiệu bằng kính hiển vi với vật kính dầu.
Chú ý: phản ứng chỉ xảy ra khi có sự tương quan về lượng giữa kháng nguyên (vi khuẩn) và kháng thể (kháng huyết thanh), do đó để tránh âm tính giả do dư thừa kháng nguyên, nên chuẩn bị các phiến kính sao cho mỗi một vi trường chỉ chứa từ 50-100 tế bào, lượng tế bào tối ưu nhất để quan sát là 25-50 tế bào vi khuẩn trong một vi trường.
Trong thử nghiệm Quellung, phế cầu khuẩn được xác định với một bộ kháng huyết thanh. Kháng huyết thanh có thể là một tập hợp của 90 loại kháng thể đặc hiệu tương ứng với 90 loại phế cầu khuẩn khác nhau (omniserum) còn gọi là kháng huyết thanh đa giá, hoặc tập hợp của một số kháng thể đặc hiệu loài hay nhóm và trong mỗi tập hợp có 4-7 loại kháng huyết thanh đơn giá (58 loại trong tổng số 90 thuộc về 20 nhóm kháng huyết thanh mà mỗi nhóm bao gồm từ 2-4 loại). Hiện nay người ta đã biết rõ 46 loại hay nhóm phế cầu khuẩn khác nhau và hơn 90% các chủng phế cầu phân lập được từ máu hay dịch não tuỷ đều thuộc về 1 trong 23 loại hay nhóm phế cầu khác nhau mà đã được chọn để sản xuất vắc xin phòng bệnh do phế cầu. Do vậy, tại một số phòng thí nghiệm người ta thường dùng 12 nhóm kháng huyết thanh (12 pooled sera) để xác định loại hay nhóm các chủng phế cầu phân lập được từ máu và dịch não tuỷ. Khi xác định týp huyết thanh hay thực hiện thử nghiệm Quellung nên tuân theo hướng dẫn của hãng sản xuất và theo mục đích dịch tễ học để chọn kháng huyết thanh. Có thể có mặt các kháng thể gây phản ứng chéo trong omniserum nên phải có sự kiểm tra hình thái học của khuẩn lạc và vi khuẩn cũng như tính bắt màu Gram của các chủng được thử nghiệm.
5.2. Nuôi cấy phân lập:
5.2.1. Cách lấy bệnh phẩm:
a/ Chất dịch đường hô hấp: trong những trường hợp viêm phổi, viêm phế quản, viêm phế quản phổi...
* Đờm: nếu là người lớn, đờm được lấy vào buổi sáng sớm, ho và khạc sâu, đờm được giữ ở hộp vô khuẩn rồi chuyển về phòng thí nghiệm trong vòng vài giờ.
* Dịch tỵ hầu (mũi-họng): nếu bệnh nhân không khạc được hoặc là trẻ nhỏ dùng tăm bông cán mảnh mềm lấy chất dịch ở ngã ba mũi - họng theo đường mũi (dịch tỵ hầu): đưa tăm bông vào sâu bằng một nửa khoảng cách tính từ cánh mũi đến dái tai cùng phía, vê nhẹ rồi rút ra. Chú ý, nếu chưa vào đủ độ sâu đã có vật cản không cố lấy mà phải làm lại ở mũi bên kia. Tăm bông phải đảm bảo không dễ bị tụt đầu bông vào khí quản và cán làm bằng kim loại mềm không gỉ không dễ gẫy khi thực hiện thao tác.
* Chất dịch hô hấp lấy bằng máy hút chân không nhẹ: cách này thay thế cho cách ngoáy tỵ hầu ở trên. Dùng ống thông plastic nhỏ mềm đưa sâu qua lỗ mũi một khoảng cách bằng khoảng cách từ đỉnh mũi đến ống tai ngoài của bệnh nhân để hút dịch.
* Ngoáy họng: đè lưỡi, dùng tăm bông vô khuẩn đã được làm ẩm bằng nước muối sinh lý (vô khuẩn) chà sát nhẹ 2 hốc amidan, thành sau họng (sau lưỡi gà). Tránh không được chạm vào lưỡi, răng, mặt trong má và lưỡi gà. Sau đó phải cắm tăm bông vào môi trường vận chuyển.
b/ Dịch não tuỷ: trong trường hợp nghi viêm màng não, dùng kim chọc tủy sống vô khuẩn lấy khoảng 2-3ml nước não tủy.
c/ Máu: trong trường hợp bệnh nhân có sốt cao, nghi viêm màng não, viêm phổi cấp, dùng bơm kim tiêm vô khuẩn lấy ít nhất 3ml máu tĩnh mạch cho ngay vào bình canh thang não-tim (brain-heart infusion) hay thioglycolate theo tỷ lệ 1 phần máu 10 phần canh thang, hoặc sử dụng chai cấy máu do các hãng thương mại pha chế sẵn. Chú ý: động tác và quá trình lấy máu, cấy máu phải đảm bảo thật vô khuẩn trong một quy trình kín. Tốt nhất, kim lấy máu được nối trực tiếp vào bình môi trường qua một ống cao su hay plastic vô khuẩn. Sát trùng vị trí lấy máu bằng cồn Iốt.
Phế cầu khuẩn cũng là một vi khuẩn rất nhạy cảm và dễ chết, vì vậy tốt nhất các bệnh phẩm nên được chuyển về phòng thí nghiệm trong vòng 2 giờ, hoặc không quá 6 giờ và có thể giữ ở nhiệt độ 4-8oC không quá 24h. Nếu quá trình luân chuyển từ 2-4 giờ bệnh phẩm có thể được cấy ngay hoặc tăng sinh trước trong canh thang (tryptocasein soya hoặc canh thang não tim) 2 giờ ở 37oC. Nếu thời gian chuyển bệnh phẩm từ 4-8 giờ, bệnh phẩm nên được ủ trong canh thang ít nhất là 2 giờ rồi mới cấy ra thạch máu 5%.
d/ Các bệnh phẩm khác: mủ amiđan, mủ tai giữa, dịch chọc phổi
5.2.2 Quy trình phân lập:
a/ Trực tiếp:nhuộm Gram quan sát hình thể và đánh giá số lượng các tế bào viêm (bạch cầu đa nhân trung tính, đại thực bào) và vi khuẩn ở trong và ngoài tế bào theo +, ++, +++
Đếm tế bào: nếu trên 25 bạch cầu đa nhân và dưới 25 tế bào biểu mô (trên tổng số 100 tế bào ở vi trường) có nhiều khả năng do nhiễm vi khuẩn. Nếu là đờm nên thuần nhất đờm trong 1-2ml nước muối sinh lý và dùng máy khuấy làm lỏng đờm trước khi dàn tiêu bản
b/ Nuôi cấy và phân lập: tùy theo từng loại bệnh phẩm để có các cách xử lý và nuôi cấy phù hợp.
* Bệnh phẩm đường hô hấp: nếu đặc cần làm lỏng đờm hoặc dịch đường hô hấp bằng N-Acetyl-L-Cystine hoặc sputolysin (có tác dụng giải phóng vi khuẩn khỏi các khối đặc của đờm và tế bào). Nên pha loãng bệnh phẩm ít nhất 10 lần trong nước muối sinh lý trước khi cấy, tốt nhất nên áp dụng phương pháp cấy đếm.
* Dịch não tủy: nên cấy song song vào thạch máu 5% (Tryptocasein soya hoặc thạch não tim có bổ xung 5% máu đã lấy hết sợi tơ huyết) và canh thang có bổ sung 5% máu (thỏ, ngựa, cừu) nhằm mục đích tăng sinh cho vi khuẩn, ủ 370C / 5% CO2, phải cấy chuyển từ canh thang tăng sinh ra thạch máu các ngày thứ 2, 3 và 7 trong trường hợp đĩa thạch máu cấy trực tiếp bệnh phẩm âm tính. Để có thể phân lập được cả loại vi khuẩn khó tính như H. influenzae, có thể cấy bệnh phẩm lên thạch sôcôla hoặc sử dụng thạch máu thỏ tươi 7% (ngoài phế cầu khuẩn và một số loại vi khuẩn khác, thạch máu thỏ tươi 7% có khả năng phân lập được cả H. influenzae)
* Máu: trong trường hợp có sốt hoặc nghi nhiễm khuẩn huyết, cấy máu theo một chu trình kín vô khuẩn (lấy 3-5ml máu tĩnh mạch cấy vào canh thang não-tim (brain-heart infusion) hay canh thang thioglycolate theo tỷ lệ 1 phần máu 10 phần canh thang hoặc cho vào chai cấy máu do các hãng sản xuất sẵn), sau đó ủ ở 370C/ 5% CO2 / 18-24 giờ. Nếu dương tính cấy chuyển sang các môi trường thạch (thạch máu 5%, thạch sôcôla).
Một số môi trường nuôi cấy phát hiện phế cầu khuẩn:
- Thạch máu 5% có Gentamycin [5μg/ml]: chỉ cho phế cầu phát triển.
- Thạch máu 5% không có Gentamycin: tìm phế cầu, liên cầu, tụ cầu và một số trực khuẩn Gram âm
- Thạch máu thỏ 7% phát hiện cả phế cầu và H.influenzae
Ủ ấm trong khí trường 370 C có 5% CO2 từ 18 - 24 giờ. Nếu không có tủ ấm CO2, đặt các hộp lồng vào chuông thủy tinh kín và đốt 1 ngọn nến, khi nến tắt cũng tạo được khí trường có CO2, sau đó đặt chuông vào tủ ấm 370 C.
Sau 18-24 giờ, quan sát trên môi trường thạch máu thấy các khuẩn lạc của phế cầu khuẩn nhỏ 0,5-1,5mm, có vỏ: nhày ướt, có xu hướng lõm giữa, có quầng tan huyết màu xanh (kiểu tan huyết alpha). Cấy thuần lại trên một đĩa thạch máu khác, ủ ấm 370C/5% CO2/18 giờ, ngày tiếp theo làm thêm các thử nghiệm sau để khẳng định (nếu chỉ thấy thuần một loại khuẩn lạc thì không cần cấy thuần mà có thể làm luôn các bước khẳng định).
c/ Các thử nghiệm xác định:
Thử nghiệm Optochin (nhạy cảm với optochin):
Cấy dày lên một đĩa thạch máu 5% vi khuẩn nghi ngờ là phế cầu, sau đó đặt khoanh giấy optochin d=6mm (chứa 5μg chất ethylhydrocupreine) lên, ủ 35-37OC/5% CO2, Sau 18-24 giờ nếu xung quanh khoanh giấy không có vòng vô khuẩn có nghĩa đó chỉ là Viridans streptococci. Nếu có vòng vô khuẩn có đường kính ≥ 14mm là dương tính (phế cầu). Nếu vòng vô khuẩn từ 9-13mm phải làm thêm thử nghiệm tan trong muối mật.
Thử nghiệm tan trong muối mật (Bile solubility):
1/ Từ nuôi cấy thuần và mới (18-24 giờ), tạo 0,5 ml canh khuẩn trong nước muối sinh lý tương đương độ đục 0,5 Mc Farland.
2/ Chia đôi canh khuẩn vào 2 ống nghiệm (0,25ml/1 ống), sau đó cho tiếp vào 1 ống canh khuẩn 0,25ml NaCl 0,9%, ống kia cho 0,25ml muối mật 2% (deoxycholate), lắc nhẹ, ủ 35-370C/ 2 giờ.
3/ Theo dõi sự ly giải tế bào vi khuẩn trong ống có muối mật sau 2 giờ ủ, nếu ống có muối mật trở nên trong, hết đục là dương tính.
Nếu thực hiện trực tiếp thử nghiệm tan trong muối mật với khuẩn lạc nghi ngờ ở trên thạch máu, phải sử dụng dung dịch sodium deoxycholate 10%, đọc kết quả sau 15-20 phút nếu là phế cầu khuẩn, khuẩn lạc sẽ biến mất hoặc dẹt hẳn xuống do bị ly giải, trong khi khuẩn lạc liên cầu không bị muối mật tác động.
Thử nghiệm ngưng kết trên phiến kính:
Dựa trên nguyên lý của phản ứng kết hợp kháng nguyên vỏ của phế cầu với kháng thể đặc hiệu tương ứng tạo sự ngưng kết. Trên thị trường thương mại các sinh phẩm sử dụng cho thử nghiệm ngưng kết trên phiến luôn có sẵn, giúp cho việc xác định các khuẩn lạc nghi ngờ có phải là phế cầu hay không. Ví dụ, bộ kit Slidex Pneumo của Vitek Systems Inc. hay Pneumoslide của BBL Microbiology Systems, Cockeysville, MD. Phải thực hiện theo đúng hướng dẫn của Nhà sản xuất.
d/ Chẩn đoán huyết thanh học:
Hiện nay đã xác định được 90 týp huyết thanh của các chủng phế cầu có vỏ gây bệnh. Người ta đã xếp thành 9 nhóm kháng huyết thanh đa giá, được ghi theo thứ tự bằng chữ cái in hoa từ A đến I, mỗi nhóm có từ 4-7 kháng huyết thanh đơn giá đặc hiệu.
* Thử nghiệm Quellung (như trên): xác định được týp huyết thanh của phế cầu (theo nhóm, hoặc theo týp đơn)
* Phương pháp định týp huyết thanh: qua các bước
· Nuôi cấy phân lập, thuần nhất vi khuẩn
· Thử nghiệm optochin dương tính
· Tạo huyền dịch vi khuẩn trong nước muối sinh lý (0,5 Mc Farland) hay canh khuẩn trong canh thang BHI có 5% máu (ủ 35-370C/5% CO2/ 4-8 giờ)
· Có thể bất hoạt vi khuẩn bằng nhỏ vài giọt Formalin vào canh khuẩn trước khi làm phản ứng với kháng huyết thanh
· Lấy một phiến kính sạch, đặt lên 1 ăng (1-2mm) kháng huyết thanh đa giá, sau đó đặt 1 ăng canh khuẩn đã bất hoạt bằng Formalin (1-2mm đường kính), trộn đều, rồi lấy 1 lá kính mỏng (lamen) đậy lên.
· Quan sát dưới kính hiển vi với thị kính X10 và vật kính X40, điều chỉnh ánh sáng để thấy rõ hiện tượng "phình" của vỏ phế cầu bởi kháng huyết thanh.
· Khi đã có dương tính với kháng huyết thanh đa giá, thử lần lượt với các kháng huyết thanh đơn giá trong nhóm để xác định týp huyết thanh của chủng phế cầu được thử.
6. Tiêu chuẩn xác định phế cầu
- Hình thể khuẩn lạc trên môi trường thạch máu 5% (có hay không có gentamycin): nhỏ, ướt, có xu hướng lõm giữa, tan huyết alpha.
- Tính chất vi khuẩn: Song cầu hình ngọn nến hay cặp mắt kính, bắt màu Gram dương (cũng có thể đứng đơn hay tạo chuỗi ngắn) nhưng phải:
- Nhạy cảm optochin: đường kính vòng vô khuẩn ≥14mm
- Hoặc: ít nhạy cảm với optochin (đường kính vòng vô khuẩn từ 9-13mm) nhưng tan trong muối mật, cũng kết luận là phế cầu khuẩn.
Không phải là phế cầu khuẩn khi:
- Không nhạy cảm với optochin
- Hoặc có vùng ức chế phát triển bởi optochin với đường kính nhỏ hơn 14mm nhưng không tan trong muối mật.
