06-30-2014, 03:24 PM
(Sửa đổi lần cuối: 06-30-2014, 03:27 PM bởi tu_hoa_luong.)
1. Phạm vi áp dụng:
- Kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán có thể áp dụng cho tất cả các phòng thí nghiệm vi sinh trong các bệnh viện và cho các trung tâm y tế dự phòng tuyến tỉnh.
- Phương pháp được áp dụng nhằm đánh giá tính nhạy cảm với kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh để giúp cho các thầy thuốc lựa chọn các thuốc kháng sinh phù hợp cho bệnh nhân.
- Sử dụng để giám sát dịch tễ học nhằm đánh giá về tình hình kháng thuốc của vi khuẩn qua đó sẽ đưa ra các biện pháp nhằm khống chế và ngăn chặn sự lây lan của vi khuẩn kháng thuốc trong bệnh viện và cộng đồng.
2. Tiêu chuẩn trích dẫn:
Sử dụng các qui trình trong sách chuyên khảo tại Việt Nam và các qui trình chuẩn thức hiện đang áp dụng trên thế giới về thử nghiệm tính nhậy cảm kháng sinh Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI).
3. Giải thích từ ngữ:
- I (Intermediate):
Trung gian
- R (Resistant):
Kháng
- S (Susceptible):
Nhạy cảm
4. Nguyên lý: Kháng sinh ở trong khoanh giấy sẽ khuếch tán vào thạch Meuler-hinton có chứa các chủng vi khuẩn thử nghiệm và mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh được biểu hiện bằng đường kính các vòng vô khuẩn xung quanh khoanh giấy kháng sinh.
5. Giới hạn tham chiếu: Phương pháp này không áp dụng để thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh với các vi khuẩn kỵ khí do những vi khuẩn này phát triển chậm và nghèo trên thạch Meuler-hinton.
6. Phương pháp xác định:
6.1. Loại mẫu: Các chủng vi khuẩn gây bệnh phân lập được từ các bệnh phẩm lâm sàng, trong các vụ dịch và ở trong môi trường ngoại cảnh.
6.2. Thiết bị, dụng cụ
- Tủ lạnh.
- Tủ ấm 370C.
- Máy trộn Voltex.
- Thước đo vòng vô khuẩn.
- Dụng cụ đặt khoanh giấy kháng sinh (Dispensing apparatus).
- Cân phân tích.
- Đèn cồn.
- Thùng khử trùng.
- Que cấy vi khuẩn.
- Bình cầu 500ml.
- Hộp lồng nhựa đáy phẳng có đường kính 90mm.
- Pipét 1ml, 5ml, 10ml các loại.
6.3. Hoá chất, thuốc thử:
6.3.1. Thạch Mueller-Hinton: Sử dụng thạch Mueller-Hinton bột đã được kiểm định chất lượng hiện đang được bán rộng rãi trên thị trường.
6.3.2. Khoanh giấy kháng sinh:
- Sử dụng khoanh giấy kháng sinh của các hãng sản xuất có bán trên thị trường cho kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán trên thạch.
- Các khoanh giấy kháng sinh phải được bảo quản trong hộp riêng trong điều kiện khô ráo, ở trong tủ lạnh nhiệt độ 80C hoặc -200C.
- Khi sử dụng xong khoanh giấy còn thừa phải được đóng kín và cất giữ trở lại tủ lạnh.
6.3.3. Nước muối sinh lý
NaCl :
8,5g
Nước cất 2 lần:
1000 ml
Hòa tan NaCl trong nước cất 2 lần.
Chỉnh pH = 7. Sấy khử trùng 1210C/15 phút.
Để trong chai vặn kín để tránh bay hơi và để ở nhiệt độ phòng và sử dụng trong vòng 6 tháng.
6.3.4. Độ đục chuẩn (McFarland): Độ đục chuẩn 0,5 McFarland phải được chuẩn bị và kiểm định chất lượng trước khi làm thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh. Nếu độ đục chuẩn được hàn kín để chống bay hơi và bảo quản trong bóng tối thì có thể sử dụng trong vòng 6 tháng. Độ đục chuẩn McFarland được sử dụng để điều chỉnh độ đục của huyền dịch nuôi cấy vi khuẩn cho thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh.
- Độ đục chuẩn 0,5 Mcfarland hiện nay rất sẵn có trên thị trường. Hoặc có thể tự chuẩn bị bằng cách trộn:
Dung dịch BaCl2.2H2O 1%:
0,5ml
Dung dịch H2SO4 1%:
99,5 ml
- Chia vào các tube và hàn kín để tránh bay hơi, các ống đục chuẩn này có thể giữ trong vòng 6 tháng trong bóng tối nhiệt ở độ phòng.
- Lắc đều trước khi sử dụng để làm tan các hạt BaSO4 kết tủa trong tube.
- Kiểm tra độ chính xác của độ đục chuẩn 0,5 Mcfaland.
- Đo bằng máy đo độ đục bước sóng 625nm: OD = 0,08-0,1.
- Hoặc sử dụng chủng chuẩn E. coli ATCC 15922: điều chỉnh huyền dịch vi khuẩn giống với độ đục chuẩn, chuẩn bị các độ pha loãng 10 lần của huyền dịch, xác định số lượng vi khuẩn bằng phương pháp đếm trên đĩa thạch. Huyền dịch vi khuẩn có cùng độ đục với độ đục chuẩn 0,5 phải có số lượng vi khuẩn là 108vk/ml.
6.3.5. Chủng chuẩn quốc tế (ATCC)
- Escherichia coli ATCC 25922
- Escherichia coli ATCC 35218
- Giữ các chủng chuẩn ở -700C trong môi trường canh thang có chứa 10% glycerol trong vòng 3 năm. Trước khi sử dụng cấy và kiểm tra lại các đặc tính sinh hóa của chủng chuẩn. Các chủng chuẩn có thể được giữ trong các ống thạch nghiêng ở nhiệt độ 2-80C trong vòng 2 tuần.
6.4. Lấy mẫu, bảo quản mẫu và vận chuyển mẫu
- Các chủng vi khuẩn sau phân lập, trước khi làm thử nghiệm kháng sinh đồ được bảo quản trong thạch mềm, hoặc thạch nghiêng.
- Khi vận chuyển, các chủng vi khuẩn phải được bảo quản trong các ống giữ chủng có nắp xoáy và đóng gói như hình 1 và vận chuyển về phòng thí nghiệm.
Hình 1: Cách đóng gói các mẫu bệnh phẩm
6.5. Các bước tiến hành
6.5.1. Chuẩn bị các đĩa thạch Mueller-Hinton
Thạch Mueller-Hinton được chuẩn bị theo các bước sau đây:
- Cân thạch một cách chính xác theo hướng dẫn của hãng sản xuất và hòa tan vào nước cất 2 lần.
- Đun sôi để hòa tan hoàn toàn thạch.
- Kiểm tra pH và chỉnh pH từ 7.2 – 7.4 nếu cần.
- Hấp tiệt trùng ở 1210C/15 phút, để nguội môi trường tới 500C.
- Đổ môi trường vào đĩa petri (đường kính 90mm) dày khoảng 4mm (tương ứng với khoảng 25ml thạch).
- Lưu ý:
o Các đĩa thạch phải được đặt trên một mặt phẳng ngang để đảm bảo độ sâu cho tất cả các vị trí trong đĩa bằng nhau cho tới khi thạch đông ở nhiệt độ phòng.
o Đổ quá nhiều hoặc quá ít thạch có thể ảnh hưởng đến kết quả của thử nghiệm: Nếu thạch quá dày có thể tạo ra kết quả kháng giả, hoặc thạch quá mỏng có thể tạo ra kết quả nhạy cảm giả.
o Dùng ngay các đĩa thạch trong ngày, nếu chưa dùng ngay thì gói kín và bảo quản ở trong tủ lạnh (2-80C) và sử dụng trong vòng 2 tuần.
o Khi sử dụng, nếu mặt thạch ướt thì phơi các đĩa thạch trong tủ ấm (35-370C) khoảng 15-30 phút. Không mở nắp đĩa thạch khi phơi để tránh bị nhiễm.
· Kiểm định chất lượng của mỗi lô thạch:
- Kiểm tra pH của môi trường trước khi đổ đĩa, pH phải nằm trong khoảng 7,2-7,4. Nếu nằm ngoài khoảng này thì không được điều chỉnh pH bằng acid hoặc kiềm mà phải bỏ đi và chuẩn bị lại lô môi trường khác.
- Sử dụng chủng chuẩn E. coli ATCC 25922.
6.5.2. Chuẩn bị chủng vi khuẩn & Pha hỗn dịch vi khuẩn
- Mỗi chủng vi khuẩnthử nghiệm trước 1 ngày cần được cấy vào môi trường thạch không có chất ức chế (thạch dinh dưỡng, thạch máu hoặc thạch não tim), để tạo ra các khuẩn lạc thuần riêng rẽ.
- Ủ các đĩa thạch qua đêm ở 370C. Dùng que cấy vô trùng lấy 1 khuẩn lạc hòa tan vào 2 ml nước muối sinh lý vô trùng và trộn đều bằng máy trộn Vortex.
- Độ đục của huyền dịch vi khuẩn sẽ được so sánh với độ đục chuẩn 0,5 McFarland dưới nền giấy trắng có kẻ các vạch đen. Lưu ý, cần phải trộn đều ống đục chuẩn trước khi dùng.
- Nếu huyền dịch vi khuẩn không có cùng độ đục với độ đục chuẩn 0,5 McFarland, có thể điều chỉnh độ đục bằng cách cho thêm nước muối sinh lý hoặc cho thêm vi khuẩn.
- Pha loãng 100 lần huyền dịch có độ đục tương đương độ đục McFaland bằng cách lấy 20µl huyền dịch này cho vào 2ml nước muối sinh lý để được huyền dịch nồng độ 106 vi khuẩn /ml.
- Ngoài ra có thể chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn bằng cách lấy 1 khuẩn lạc từ đĩa thạch nuôi cấy qua đêm cho vào môi trường (canh thang Mueller-Hinton, canh thang não tim, hoặc canh thang trypton soy). Ủ ở 370C cho tới khi vi khuẩn mọc đục, sau đó điều chỉnh để có được độ đục huyền dịch vi khuẩn phù hợp cho thử nghiệm.
- Lưu ý: luôn luôn phải làm song song thử nghiệm với các chủng chuẩn Quốc tế để kiểm tra chất lượng của qui trình.
6.5.3. Láng vi khuẩn lên đĩa thạch
- Sử dụng ngay huyền dịch nồng độ 106 vi khuẩn/ml (trong vòng 15 phút) láng đều lên mặt thạch Mueller-Hinton.
- Hút huyền dịch vi khuẩn thừa bỏ đi.
- Để khô mặt các đĩa thạch bằng cách đặt chúng vào trong tủ ấm 15 phút trước khi đặt kháng sinh.
6.5.4. Đặt khoanh giấy kháng sinh
- Lấy khoanh giấy kháng sinh ra khỏi tủ lạnh hoặc tủ âm, không được mở nắp, để ở nhiệt độ phòng khoảng 1 giờ để ổn định và làm giảm hơi nước tích tụ trên khoanh giấy kháng sinh.
- Khoanh giấy kháng sinh được đặt càng sớm càng tốt, trong vòng 15 phút sau khi láng vi khuẩn lên đĩa thạch.
- Sử dụng dụng cụ để đặt kháng sinh (Disk-dispensing apparatus), dụng cụ này phải được đóng nắp chặt, cất trở lại vào trong tủ lạnh và làm ấm ở nhiệt độ phòng trước khi sử dụng.
- Có thể sử dụng kẹp đầu nhọn vô trùng để đặt từng khoanh giấy kháng sinh lên đĩa thạch hoặc dùng dụng cụ để đặt khoanh giấy kháng sinh nhẹ nhàng lên đĩa thạch.
- Không nên đặt quá 6 khoanh giấy lên đĩa thạch 90mm.
- Không di chuyển khoanh giấy khi đã tiếp xúc với mặt thạch để tránh các vòng ức chế chồng chéo lên nhau và có thể gây sai số khi đo vòng ức chế.
- Để các đĩa thạch ở nhiệt độ phòng trong 30 phút cho kháng sinh từ các khoanh giấy khuếch tán trên mặt thạch.
- Lộn ngược các đĩa thạch và ủ ấm ở 370C trong vòng 18-20 giờ.
6.5.5. Đọc và phân tích kết quả
- Sau khi ủ ấm lấy các đĩa thạch ra khỏi tủ ấm. Đo và ghi lại kích thước vòng vô khuẩn (dùng thước đo từ mặt sau của đĩa và không được mở nắp) của chủng chuẩn.
- So sánh kết quả của chủng chuẩn với bảng chuẩn. Nếu phù hợp nghĩa là qui trình thực hiện đúng, tiếp tục đọc kết quả vòng vô khuẩn của chủng thử nghiệm. Nếu không phù hợp, qui trình thực hiện chưa đúng hoặc hóa chất sinh phẩm hỏng, không phù hợp, cần phải tiến hành lại.
- So sánh kích thước vòng vô khuẩn của chủng thử nghiệm với vòng ức chế chuẩn (bảng 1), sau đó ghi lại kết quả của từng loại kháng sinh được thử nghiệm như là: nhạy cảm (S), trung bình (I) và kháng ®.
- Nếu có hiện tượng khuẩn lạc mọc trong vòng ức chế thì đây có thể xuất hiện sự thay đổi tính kháng của vi khuẩn hoặc do các huyền dịch vi khuẩn bị trộn lẫn vào với nhau. Các khuẩn lạc này nên được nuôi cấy, phân lập và thử nghiệm lại tính nhạy cảm với kháng sinh.
Sơ đồ 1: Qui trình thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh bằng kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán
6.6. Độ tin cậy
- Qui trình Kỹ thuật này được xây dựng dựa trên các thường qui chuẩn thức của Việt Nam và dựa trên qui trình thao tác chuẩn về thử nghiệm tính nhậy cảm kháng sinh của CLSI (Clinical Laboratory Standard Institute) năm 2010. Qui trình này đã được đánh giá tại phòng thí nghiệm Kháng sinh - Khoa Vi khuẩn -Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương. Nếu thực hiện qui trình một cách chính xác, sẽ thu được các kết quả mà qua đó có thể dự báo được một cách chắc chắn các kháng sinh có tác dụng trên lâm sàng.
- Tuy nhiên, nếu xảy bất kỳ một sai sót nào trong khi thực hiện có thể dẫn đến các kết quả sai lệch. Do vậy, nếu các phòng thí nghiệm không đủ các nguồn lực cần thiết để thực hiện kỹ thuật một cách chính xác như thường qui thì nên gửi các chủng vi khuẩn phân lập được đến các phòng thí nghiệm khác để làm thử nghiệm.
7. Báo cáo kết quả(hình)
8. Kiểm soát chất lượng:
- Để đảm bảo một cách chính xác của qui trình cần phải kiểm tra chất lượng của từng loạt môi trường sau khi pha và hoạt tính của khoanh giấy kháng sinh bằng các chủng chuẩn quốc tế.
- Các chủng chuẩn quốc tế phải được thử nghiệm song song với các chủng thử nghiệm nhằm đảm bảo sự chính xác của kết quả.
- Tuân thủ một cách chính xác qui trình xét nghiệm.
- Ghi lại đầy đủ nhật ký làm việc sẽ giúp chúng ta theo dõi và kiểm soát một cách dễ dàng toàn bộ qui trình thử nghiệm.
9. Các yêu cầu về an toàn: Các cán bộ khi làm thử nghiệm phải tuân thủ đầy đủ nguyên tắc về an toàn khi làm việc với các vi khuẩn gây bệnh.
- Mặc quần áo bảo hộ lao động, đội mũ, đeo găng và mang khẩu trang.
- Không ăn uống hay mang thức ăn vào phòng xét nghiệm.
10. Chất thải phát sinh và phương pháp xử lý: Chất thải của qui trình xét nghiệm phải được cho các túi đựng các chất thải nguy hiểm hoặc cho vào phòng khử trùng và được hấp xấy ở 1210C trong vòng 15 phút.
- Kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán có thể áp dụng cho tất cả các phòng thí nghiệm vi sinh trong các bệnh viện và cho các trung tâm y tế dự phòng tuyến tỉnh.
- Phương pháp được áp dụng nhằm đánh giá tính nhạy cảm với kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh để giúp cho các thầy thuốc lựa chọn các thuốc kháng sinh phù hợp cho bệnh nhân.
- Sử dụng để giám sát dịch tễ học nhằm đánh giá về tình hình kháng thuốc của vi khuẩn qua đó sẽ đưa ra các biện pháp nhằm khống chế và ngăn chặn sự lây lan của vi khuẩn kháng thuốc trong bệnh viện và cộng đồng.
2. Tiêu chuẩn trích dẫn:
Sử dụng các qui trình trong sách chuyên khảo tại Việt Nam và các qui trình chuẩn thức hiện đang áp dụng trên thế giới về thử nghiệm tính nhậy cảm kháng sinh Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI).
3. Giải thích từ ngữ:
- I (Intermediate):
Trung gian
- R (Resistant):
Kháng
- S (Susceptible):
Nhạy cảm
4. Nguyên lý: Kháng sinh ở trong khoanh giấy sẽ khuếch tán vào thạch Meuler-hinton có chứa các chủng vi khuẩn thử nghiệm và mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh được biểu hiện bằng đường kính các vòng vô khuẩn xung quanh khoanh giấy kháng sinh.
5. Giới hạn tham chiếu: Phương pháp này không áp dụng để thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh với các vi khuẩn kỵ khí do những vi khuẩn này phát triển chậm và nghèo trên thạch Meuler-hinton.
6. Phương pháp xác định:
6.1. Loại mẫu: Các chủng vi khuẩn gây bệnh phân lập được từ các bệnh phẩm lâm sàng, trong các vụ dịch và ở trong môi trường ngoại cảnh.
6.2. Thiết bị, dụng cụ
- Tủ lạnh.
- Tủ ấm 370C.
- Máy trộn Voltex.
- Thước đo vòng vô khuẩn.
- Dụng cụ đặt khoanh giấy kháng sinh (Dispensing apparatus).
- Cân phân tích.
- Đèn cồn.
- Thùng khử trùng.
- Que cấy vi khuẩn.
- Bình cầu 500ml.
- Hộp lồng nhựa đáy phẳng có đường kính 90mm.
- Pipét 1ml, 5ml, 10ml các loại.
6.3. Hoá chất, thuốc thử:
6.3.1. Thạch Mueller-Hinton: Sử dụng thạch Mueller-Hinton bột đã được kiểm định chất lượng hiện đang được bán rộng rãi trên thị trường.
6.3.2. Khoanh giấy kháng sinh:
- Sử dụng khoanh giấy kháng sinh của các hãng sản xuất có bán trên thị trường cho kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán trên thạch.
- Các khoanh giấy kháng sinh phải được bảo quản trong hộp riêng trong điều kiện khô ráo, ở trong tủ lạnh nhiệt độ 80C hoặc -200C.
- Khi sử dụng xong khoanh giấy còn thừa phải được đóng kín và cất giữ trở lại tủ lạnh.
6.3.3. Nước muối sinh lý
NaCl :
8,5g
Nước cất 2 lần:
1000 ml
Hòa tan NaCl trong nước cất 2 lần.
Chỉnh pH = 7. Sấy khử trùng 1210C/15 phút.
Để trong chai vặn kín để tránh bay hơi và để ở nhiệt độ phòng và sử dụng trong vòng 6 tháng.
6.3.4. Độ đục chuẩn (McFarland): Độ đục chuẩn 0,5 McFarland phải được chuẩn bị và kiểm định chất lượng trước khi làm thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh. Nếu độ đục chuẩn được hàn kín để chống bay hơi và bảo quản trong bóng tối thì có thể sử dụng trong vòng 6 tháng. Độ đục chuẩn McFarland được sử dụng để điều chỉnh độ đục của huyền dịch nuôi cấy vi khuẩn cho thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh.
- Độ đục chuẩn 0,5 Mcfarland hiện nay rất sẵn có trên thị trường. Hoặc có thể tự chuẩn bị bằng cách trộn:
Dung dịch BaCl2.2H2O 1%:
0,5ml
Dung dịch H2SO4 1%:
99,5 ml
- Chia vào các tube và hàn kín để tránh bay hơi, các ống đục chuẩn này có thể giữ trong vòng 6 tháng trong bóng tối nhiệt ở độ phòng.
- Lắc đều trước khi sử dụng để làm tan các hạt BaSO4 kết tủa trong tube.
- Kiểm tra độ chính xác của độ đục chuẩn 0,5 Mcfaland.
- Đo bằng máy đo độ đục bước sóng 625nm: OD = 0,08-0,1.
- Hoặc sử dụng chủng chuẩn E. coli ATCC 15922: điều chỉnh huyền dịch vi khuẩn giống với độ đục chuẩn, chuẩn bị các độ pha loãng 10 lần của huyền dịch, xác định số lượng vi khuẩn bằng phương pháp đếm trên đĩa thạch. Huyền dịch vi khuẩn có cùng độ đục với độ đục chuẩn 0,5 phải có số lượng vi khuẩn là 108vk/ml.
6.3.5. Chủng chuẩn quốc tế (ATCC)
- Escherichia coli ATCC 25922
- Escherichia coli ATCC 35218
- Giữ các chủng chuẩn ở -700C trong môi trường canh thang có chứa 10% glycerol trong vòng 3 năm. Trước khi sử dụng cấy và kiểm tra lại các đặc tính sinh hóa của chủng chuẩn. Các chủng chuẩn có thể được giữ trong các ống thạch nghiêng ở nhiệt độ 2-80C trong vòng 2 tuần.
6.4. Lấy mẫu, bảo quản mẫu và vận chuyển mẫu
- Các chủng vi khuẩn sau phân lập, trước khi làm thử nghiệm kháng sinh đồ được bảo quản trong thạch mềm, hoặc thạch nghiêng.
- Khi vận chuyển, các chủng vi khuẩn phải được bảo quản trong các ống giữ chủng có nắp xoáy và đóng gói như hình 1 và vận chuyển về phòng thí nghiệm.
Hình 1: Cách đóng gói các mẫu bệnh phẩm
6.5. Các bước tiến hành
6.5.1. Chuẩn bị các đĩa thạch Mueller-Hinton
Thạch Mueller-Hinton được chuẩn bị theo các bước sau đây:
- Cân thạch một cách chính xác theo hướng dẫn của hãng sản xuất và hòa tan vào nước cất 2 lần.
- Đun sôi để hòa tan hoàn toàn thạch.
- Kiểm tra pH và chỉnh pH từ 7.2 – 7.4 nếu cần.
- Hấp tiệt trùng ở 1210C/15 phút, để nguội môi trường tới 500C.
- Đổ môi trường vào đĩa petri (đường kính 90mm) dày khoảng 4mm (tương ứng với khoảng 25ml thạch).
- Lưu ý:
o Các đĩa thạch phải được đặt trên một mặt phẳng ngang để đảm bảo độ sâu cho tất cả các vị trí trong đĩa bằng nhau cho tới khi thạch đông ở nhiệt độ phòng.
o Đổ quá nhiều hoặc quá ít thạch có thể ảnh hưởng đến kết quả của thử nghiệm: Nếu thạch quá dày có thể tạo ra kết quả kháng giả, hoặc thạch quá mỏng có thể tạo ra kết quả nhạy cảm giả.
o Dùng ngay các đĩa thạch trong ngày, nếu chưa dùng ngay thì gói kín và bảo quản ở trong tủ lạnh (2-80C) và sử dụng trong vòng 2 tuần.
o Khi sử dụng, nếu mặt thạch ướt thì phơi các đĩa thạch trong tủ ấm (35-370C) khoảng 15-30 phút. Không mở nắp đĩa thạch khi phơi để tránh bị nhiễm.
· Kiểm định chất lượng của mỗi lô thạch:
- Kiểm tra pH của môi trường trước khi đổ đĩa, pH phải nằm trong khoảng 7,2-7,4. Nếu nằm ngoài khoảng này thì không được điều chỉnh pH bằng acid hoặc kiềm mà phải bỏ đi và chuẩn bị lại lô môi trường khác.
- Sử dụng chủng chuẩn E. coli ATCC 25922.
6.5.2. Chuẩn bị chủng vi khuẩn & Pha hỗn dịch vi khuẩn
- Mỗi chủng vi khuẩnthử nghiệm trước 1 ngày cần được cấy vào môi trường thạch không có chất ức chế (thạch dinh dưỡng, thạch máu hoặc thạch não tim), để tạo ra các khuẩn lạc thuần riêng rẽ.
- Ủ các đĩa thạch qua đêm ở 370C. Dùng que cấy vô trùng lấy 1 khuẩn lạc hòa tan vào 2 ml nước muối sinh lý vô trùng và trộn đều bằng máy trộn Vortex.
- Độ đục của huyền dịch vi khuẩn sẽ được so sánh với độ đục chuẩn 0,5 McFarland dưới nền giấy trắng có kẻ các vạch đen. Lưu ý, cần phải trộn đều ống đục chuẩn trước khi dùng.
- Nếu huyền dịch vi khuẩn không có cùng độ đục với độ đục chuẩn 0,5 McFarland, có thể điều chỉnh độ đục bằng cách cho thêm nước muối sinh lý hoặc cho thêm vi khuẩn.
- Pha loãng 100 lần huyền dịch có độ đục tương đương độ đục McFaland bằng cách lấy 20µl huyền dịch này cho vào 2ml nước muối sinh lý để được huyền dịch nồng độ 106 vi khuẩn /ml.
- Ngoài ra có thể chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn bằng cách lấy 1 khuẩn lạc từ đĩa thạch nuôi cấy qua đêm cho vào môi trường (canh thang Mueller-Hinton, canh thang não tim, hoặc canh thang trypton soy). Ủ ở 370C cho tới khi vi khuẩn mọc đục, sau đó điều chỉnh để có được độ đục huyền dịch vi khuẩn phù hợp cho thử nghiệm.
- Lưu ý: luôn luôn phải làm song song thử nghiệm với các chủng chuẩn Quốc tế để kiểm tra chất lượng của qui trình.
6.5.3. Láng vi khuẩn lên đĩa thạch
- Sử dụng ngay huyền dịch nồng độ 106 vi khuẩn/ml (trong vòng 15 phút) láng đều lên mặt thạch Mueller-Hinton.
- Hút huyền dịch vi khuẩn thừa bỏ đi.
- Để khô mặt các đĩa thạch bằng cách đặt chúng vào trong tủ ấm 15 phút trước khi đặt kháng sinh.
6.5.4. Đặt khoanh giấy kháng sinh
- Lấy khoanh giấy kháng sinh ra khỏi tủ lạnh hoặc tủ âm, không được mở nắp, để ở nhiệt độ phòng khoảng 1 giờ để ổn định và làm giảm hơi nước tích tụ trên khoanh giấy kháng sinh.
- Khoanh giấy kháng sinh được đặt càng sớm càng tốt, trong vòng 15 phút sau khi láng vi khuẩn lên đĩa thạch.
- Sử dụng dụng cụ để đặt kháng sinh (Disk-dispensing apparatus), dụng cụ này phải được đóng nắp chặt, cất trở lại vào trong tủ lạnh và làm ấm ở nhiệt độ phòng trước khi sử dụng.
- Có thể sử dụng kẹp đầu nhọn vô trùng để đặt từng khoanh giấy kháng sinh lên đĩa thạch hoặc dùng dụng cụ để đặt khoanh giấy kháng sinh nhẹ nhàng lên đĩa thạch.
- Không nên đặt quá 6 khoanh giấy lên đĩa thạch 90mm.
- Không di chuyển khoanh giấy khi đã tiếp xúc với mặt thạch để tránh các vòng ức chế chồng chéo lên nhau và có thể gây sai số khi đo vòng ức chế.
- Để các đĩa thạch ở nhiệt độ phòng trong 30 phút cho kháng sinh từ các khoanh giấy khuếch tán trên mặt thạch.
- Lộn ngược các đĩa thạch và ủ ấm ở 370C trong vòng 18-20 giờ.
6.5.5. Đọc và phân tích kết quả
- Sau khi ủ ấm lấy các đĩa thạch ra khỏi tủ ấm. Đo và ghi lại kích thước vòng vô khuẩn (dùng thước đo từ mặt sau của đĩa và không được mở nắp) của chủng chuẩn.
- So sánh kết quả của chủng chuẩn với bảng chuẩn. Nếu phù hợp nghĩa là qui trình thực hiện đúng, tiếp tục đọc kết quả vòng vô khuẩn của chủng thử nghiệm. Nếu không phù hợp, qui trình thực hiện chưa đúng hoặc hóa chất sinh phẩm hỏng, không phù hợp, cần phải tiến hành lại.
- So sánh kích thước vòng vô khuẩn của chủng thử nghiệm với vòng ức chế chuẩn (bảng 1), sau đó ghi lại kết quả của từng loại kháng sinh được thử nghiệm như là: nhạy cảm (S), trung bình (I) và kháng ®.
- Nếu có hiện tượng khuẩn lạc mọc trong vòng ức chế thì đây có thể xuất hiện sự thay đổi tính kháng của vi khuẩn hoặc do các huyền dịch vi khuẩn bị trộn lẫn vào với nhau. Các khuẩn lạc này nên được nuôi cấy, phân lập và thử nghiệm lại tính nhạy cảm với kháng sinh.
Sơ đồ 1: Qui trình thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh bằng kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán
6.6. Độ tin cậy
- Qui trình Kỹ thuật này được xây dựng dựa trên các thường qui chuẩn thức của Việt Nam và dựa trên qui trình thao tác chuẩn về thử nghiệm tính nhậy cảm kháng sinh của CLSI (Clinical Laboratory Standard Institute) năm 2010. Qui trình này đã được đánh giá tại phòng thí nghiệm Kháng sinh - Khoa Vi khuẩn -Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương. Nếu thực hiện qui trình một cách chính xác, sẽ thu được các kết quả mà qua đó có thể dự báo được một cách chắc chắn các kháng sinh có tác dụng trên lâm sàng.
- Tuy nhiên, nếu xảy bất kỳ một sai sót nào trong khi thực hiện có thể dẫn đến các kết quả sai lệch. Do vậy, nếu các phòng thí nghiệm không đủ các nguồn lực cần thiết để thực hiện kỹ thuật một cách chính xác như thường qui thì nên gửi các chủng vi khuẩn phân lập được đến các phòng thí nghiệm khác để làm thử nghiệm.
7. Báo cáo kết quả(hình)
8. Kiểm soát chất lượng:
- Để đảm bảo một cách chính xác của qui trình cần phải kiểm tra chất lượng của từng loạt môi trường sau khi pha và hoạt tính của khoanh giấy kháng sinh bằng các chủng chuẩn quốc tế.
- Các chủng chuẩn quốc tế phải được thử nghiệm song song với các chủng thử nghiệm nhằm đảm bảo sự chính xác của kết quả.
- Tuân thủ một cách chính xác qui trình xét nghiệm.
- Ghi lại đầy đủ nhật ký làm việc sẽ giúp chúng ta theo dõi và kiểm soát một cách dễ dàng toàn bộ qui trình thử nghiệm.
9. Các yêu cầu về an toàn: Các cán bộ khi làm thử nghiệm phải tuân thủ đầy đủ nguyên tắc về an toàn khi làm việc với các vi khuẩn gây bệnh.
- Mặc quần áo bảo hộ lao động, đội mũ, đeo găng và mang khẩu trang.
- Không ăn uống hay mang thức ăn vào phòng xét nghiệm.
10. Chất thải phát sinh và phương pháp xử lý: Chất thải của qui trình xét nghiệm phải được cho các túi đựng các chất thải nguy hiểm hoặc cho vào phòng khử trùng và được hấp xấy ở 1210C trong vòng 15 phút.