[LTTH] Phương pháp điện di

[tuyenlab]

Phư­ơng pháp điện di

1. Nguyên lý

Protein là những phân tử tích điện, khi đặt trong điện trư­ờng, sẽ di chuyển về phía điện cực trái dấu với chúng.

2. Độ di động điện di

Khi một hạt tích điện Ne đ­ợc đặt trong điện tr­ường E, nó chịu một lực F đư­ợc tính theo định luật Coulomb:

F = Ne . E

Hạt sẽ di chuyển và đạt tới vận tốc giới hạn v khi lực ma sát bằng lực Coulomb:

f. v = - Ne. E

Độ di động điện di của hạt đ­ợc tính nh­ sau:

m = v/E = Ne/F

Đối với các phân tử đơn giản, đ­ợc coi là hình cầu, nh­ protein globulin của huyết thanh, hệ số ma sát f có giá trị là:

f = 6. p.h.r

trong đó r là bán kính của cầu và h là độ nhớt của dung môi.

Thực tế, các phân tử protein đ­ợc bao bọc bởi một lớp ion và n­ớc, làm biến đổi điện tích thực và bán kính của nó. Vì vậy, để trao đổi ion, pH phải lớn và phải xa pH đẳng điện - pHi (ở pHi hạt không di chuyển). Ví dụ nh­, tất cả protein huyết thanh di chuyển trong điện tr­ờng về phía cực d­ơng (anode) khi đ­ợc đặt ở pH= 8,6.

Dòng gây nhiễu:

Trên một chất giá rắn, có các hiện t­ợng khác can thiệp vào độ di động thực của phân tử:

- Dòng điện thẩm thấu (electro-osmose): khi đặt một hiệu điện thế giữa hai đầu của một đoạn chất rắn đ­ợc thấm ­ớt bởi chất điện ly, sẽ có sự di chuyển của dung môi về một trong các cực, do sự tạo thành một lớp điện tích, thư­ờng là âm, ở bề mặt của các kênh của bề mặt lỗ. Khi đó, chất điện ly có thừa điện tích d­ơng và sẽ di chuyển về phía cực âm (cathode). ảnh h­ưởng này phụ thuộc vào điện thế cuả lớp kép đ­ợc tạo ra ở bề mặt của mao quản. Điện thế này lại phụ thuộc vào bản chất của chất có lỗ đ­ợc dùng, vào điện tr­ờng đ­ợc đặt, vào lực ion của chất điện ly và độ nhớt của chúng. Có thể hạn chế đáng kể hiện t­ợng này bằng một số cách, nh­ dùng một màng bán thấm để bọc chất giá ở mức độ điện cực, hoặc dùng một dòng thuỷ động ngư­ợc và chất bù trừ.

- Dòng điện đối l­u (electrorheophorese): là một dòng hơi do sự bốc hơi của dung môi bởi nhiệt. Để hạn chế hiện t­ợng này, khi chạy điện di điện thế thấp (230 V) dùng trong thực hành lâm sàng hàng ngày, ng­ời ta dùng nắp có mái để đậy máy; còn khi chạy điện di điện thế cao (trên 1000 V), ng­ời ta phải đặt trong hệ thống làm lạnh.

4. áp dụng

- Có nhiều kiểu điện di đư­ợc dùng trong phòng thí nghiệm cũng nưh­ trong công nghiệp, tuỳ theo mục đích và điều kiện phân tích. Trong hóa sinh y học thường ngày, điện di th­ờng đ­ợc dùng để phân tích các protein huyết thanh, nư­ớc tiểu cũng nh­ư các dịch sinh học khác. Sự di chuyển của protein phụ thuộc vào bán kính r của nó, vào pH đẳng điện - pHi (pH mà ở đó, protein không mang điện tích hay có tổng điện tích âm bằng tổng điện tích dư­ơng)

- Để nhận biết các protein đã phân chia, ng­ời ta dùng nhiều ph­ơng pháp tuỳ theo kỹ thuật điện di đ­ược sử dụng:

. Thông dụng nhất là dùng các chất nhuộm màu đặc hiệu (đỏ Ponceau, Amido đen, xanh Croomassie…), sau đó định lư­ợng các phần đã phân chia.

. Dùng kỹ thuật miễn dịch nhậy và đặc hiệu.

Các acid nucleic cũng có thể phân chia bằng điện di, nh­ưng gần đây ngư­ời ta th­ường dùng các kỹ thuật sinh học phân tử hơn.

• - Phân tích kết quả: Bằng densitometor

Densitometor cho phép đọc mật độ quang học của các băng và biểu thị theo nguyên lý đo quang phổ. Cấu tạo của densitometor gồm: nguồn sáng, kính lọc (có bư­ớc sóng thích hợp với màu của băng), bộ nhân quang, bộ ghi, bộ tính toán và bộ in.

Khi chiếu ánh sáng đơn sắc vào băng màu, một phần ánh sáng bị hấp thụ, phần còn lại bị phản xạ. Phần hấp thụ càng lớn khi mật độ chất màu ở băng màu càng lớn và do đó phần phản xạ càng nhỏ. Đo ánh sáng phản xạ và biến đổi thành dòng điện đo đư­ợc sẽ xác định đ­ợc mật độ chất màu

5. Các phư­ơng pháp điện di

5.1. Điện di trong lòng dịch và điện di giấy,

- Điện di trong lòng dịch: đã đ­ợc Tiselius mô tả đầu tiên để phân chia protein huyết thanh. Hiện nay, nó không còn đ­ợc dùng nữa , nh­ng vẫn còn đ­ược xem nh­ư một qui chiếu để đo độ di động điện di thực, vì không có dòng thuỷ động gây nhiễu và không có sự can thiệp của chất giá.

- Điện di giấy: Giấy là chất giá rắn đ­ược dùng lần đầu tiên, nh­ng nay ít dùng vì đã có các chất giá có khả năng giải quyết tốt hơn và thực tế hơn, song nó vẫn có những ­u điểm (ví dụ, trong phân loại rối loạn lipoprotein máu theo Fredrickson)

5.2. Điện di trên màng cellulose acetat

Màng cellulose acetat là chất giá quen thuộc để phân chia protein huyết thanh trong xét nghiệm hàng ngày. Chấm một lư­ợng nhỏ huyết thanh trên màng cellulose acetat d­ới dạng một vạch nhỏ bằng bộ chấm mẫu chuyên dụng. Sau khi chạy điện di (khoảng 30 phút ở 230V) và nhuộm các protein, màng đư­ợc làm trong bằng sấy khô, rồi đọc kết quả trên máy đo mật độ (densitometor)

5.3. Điện di trên gel

5.3.1.Điện di trên gel acrylamid :

Ph­ơng pháp này sử dụng một gel có lỗ thu đư­ợc bằng sự copolymer hóa acrylamid và N-N’-methylen bis-acrylamid nhờ một phản ứng gốc d­ới ánh sáng với sự có mặt của một chất xúc tác như­ persulfat ammon hoặc riboflavin.

Kích thư­ớc của lỗ gel phụ thuộc vào tỷ lệ t­ơng đối giữa hai thành phần trên và vào acrylamid. Các gel acrylamid dùng để phân chia protein huyết thanh th­ờng chứa 7-12% acrylamid. Có thể tạo ra gradient nồng độ acrylamid liên tục (ví dụ, từ 4 đến 30%) hoặc không liên tục.

Các gel acrylamid dễ chuẩn bị trong các phòng xét nghiệm, nh­ng cần thận trọng vì acrylamid là một chất độc thần kinh.

Có nhiều kỹ thuật đ­ợc dùng:

+ Điện di gel trong ống thuỷ tinh (điện di cột): (a) th­ờng dùng ống dài 5-10 cm, đ­ờng kính 0,5- 0,8 mm.

+ Điện di gel giữa hai tấm thuỷ tinh (b) hoặc điện di phiến gel (slab - gel electrophorese): cho phép so sánh dễ dàng giữa các mẫu thử vì đ­ợc tiến hành trong cùng điều kiện giống hệt nhau.

Kích th­ước của tấm có thể thay đổi: th­ường rộng từ 8-15 cm, cao 8-20 cm. Các gel đ­ược dùng để xác định trình tự của acid nucleic thì dài hơn (30-40 cm) so với để phân chia protein. Chiều dày của gel th­ờng dùng là 0,75 đến 2,5 cm. Các hố đ­ược đục nhờ một que nhựa nhét vào giữa hai tấm thuỷ tinh khi polymer hóa. Trên thị tr­ường có bán các tấm có sẵn để dùng.

+ Điện di gel trên phim nhựa: Mẫu thử đ­ợc đặt trong các hố nằm trong gel hoặc ở bề mặt gel để khuếch tán trong gel trư­ớc khi đặt trong điện trư­ờng.

Điều kiện điện di:

Trong lư­ới gel acrylamid, các phân tử đư­ợc phân chia theo kích thư­ớc (trọng lư­ợng phân tử) và điện tích của chúng. Do đó có hai kiểu điện di đ­ợc dùng:

. Điện di không biến tính: Trong một gel có lỗ hằng định, cả hai thống số kích th­ớc và điện tích đều can thiệp vào sự di chuyển của các protein. Còn trong một gel với gradient của acrylamid thì chỉ có kích th­ước là thông số can thiệp: các protein không qua đư­ợc lỗ do kích th­ớc của chúng lớn hơn kích th­ớc lỗ. Đối với các lipoprotein, ngư­ời ta dùng một gel với 2 lớp acrylamid có nồng độ khác nhau (gradient không liên tục): lớp thứ nhất, nồng độ thấp hơn, có lỗ lớn hơn, chỉ cho các phân tử lớn (chylomicron) đi qua; lớp thứ hai có nồng độ acrylamid cao hơn, giữ lại các phân tử nhỏ hơn một chút (VLDL) và cho qua các phân tử nhỏ mà khi phân chia theo kích thư­ớc và điện tích của chúng sẽ thành LDL và HDL. Như­ vậy, ngư­ời ta tách đ­ược các lipoprrotein thành 4 lớp có ý nghĩa chẩn đoán và tiên l­ượng khác nhau. Sự phân chia cũng đư­ợc thực hiện bằng kỹ thuật siêu ly tâm như­ng có thể thực hiện với nhiều mẫu thử, tốn ít thời gian và dùng ít mẫu hơn.

Điện di biến tính: Làm biến tính các protein bằng cách đun nóng trong dung dịch chứa các chất khử (nh­ b-mercapto-ẹthanol) để cắt các cầu disulfua và một chất tẩy, natri dodecyl-sulfat (SDS).

SDS gắn với bề mặt protein làm cho chúng tích điện âm. Sự di chuyển của protein trong gel acrylamid thực tế chỉ phụ thuộc duy nhất vào trọng l­ợng phân tử của chúng. Phư­ơng pháp này đơn giản, nhanh, chính xác và thực tế đ­ược dùng thay cho phần lớn các ph­ương pháp lý học (siêu ly tâm phân tích, khếch tán ánh sáng…) trong xác định trọng lư­ợng protein. Gần đây, cetyl-triammon-bromua (CTAB) đã đ­ợc đề nghị sử dụng thay cho SDS, vì nó tư­ơng đối giữ đư­ợc hoạt tính sinh học sau khi điện di, còn SDS thì không.

5.3.2. Điện di trên các gel khác:

Gel tinh bột và gel agarose thu đ­ợc bằng đun nóng sau đó làm lạnh là những polymer glucid. Nó không có tác dụng sàng phân tử nh­ acrylamid, như­ng kích thư­ớc lỗ lớn của gel cho phép nhận biết enzym. Vì so với giấy hoặc màng cellulose acetat, chiều dày của gel cho phép chứa một l­ượng mẫu thử lớn hơn

5.4. Điện di hội tụ (Electrofocalisafion)

Đó là một kiểu điện di thực hiện trong gradient pH. Các thành phần di chuyển theo điểm đẳng điện và dừng lại ở vùng có pH t­ơng ứng với pH đẳng điện của chúng. Gradient pH đ­ợc tạo ra trong quá trình điện di bởi một hỗn hợp của một số lớn các hạt aminoacid có pH đẳng điện khác nhau (ampholytes). Tuỳ theo thành phần của hỗn hợp, ngư­ời ta thu đ­ược một thang pH nào đó và nh­ vậy một khả năng giải quyết tốt hơn.

Có thể thực hiện theo 2 cách:

- Hoặc trong môi tr­ường lỏng, trong cột, gradient đ­ợc tạo ra bởi gradient saccharose.

- Hoặc trong môi trư­ờng rắn: trên một gel (agarose hoặc acrylamid).

Anode đ­ợc tạo bởi acid, còn cathode đ­ợc tạo bởi một base. Sử dụng điện thế rất lớn: 1 000 đến 2 000 V và cần hệ thống làm lạnh.

Phư­ơng pháp này đ­ợc dùng trong nghiên cứu vì khả năng giải quyết của nó trong hóa sinh protein rất lớn.

5.5. Điện di hai chiều (Electrophorese bidimensionnell)

Thực hiện 2 lần điện di theo 2 hư­ớng vuông góc với nhau. Có thể kết hợp điện di acrylamide-agarosse, điện di đơn và điện di hội tụ….Trong thực hành, đầu tiên ng­ười ta thực hiện điện di hội tụ theo một h­ướng, rồi điện di gel acrylamide-SDS theo h­ớng thứ hai.

5.6. Điện di mao quản (Electrophorese capillaire)

Gel acrylamide hoặc gel khác bền trong môi trư­ờng điện di và hạn chế đ­ược độ rộng của băng khi phân chia. Các mao quản (có đư­ờng kính trong từ 10-100mm) cho phép phân chia trong một thời gian ngắn và giá rẻ hơn. Dùng mao quản sẽ làm tăng tỷ lệ bề mặt/thể tích làm cho dễ thoát nhiệt đ­ợc sinh ra khi điện di và hạn chế sự khuếch tán do nhiệt.

5.7. Điện di miễn dịch

Điện di miễn dịch đ­ợc thực hiện trong gel agarose trên một lam kính hoặc trên phim nhựa, cho phép phân tích đồng thời nhiều mẫu thử. Kỹ thuật này kết hợp 2 giai đoạn kế tiếp:

- Điện di trong một trư­ờng thứ nhất: các protein đ­ược phân chia bởi điện di bắt đầu từ một hố nhỏ đư­ợc đục trong gel agarose. Vì thế, mỗi protein đ­ược phân chia có hình ellip kéo dài.

- Khuếch tán miễn dịch trong một tr­ờng thứ hai: trong một máng đ­ược đục song song với h­ớng của giai đoạn một, ng­ời ta đặt một kháng huyết thanh vào đó, nó sẽ khuếch tán vuông góc với máng. Các protẹin đã phân chia cũng khuếch tán bắt đầu từ vết thu đ­ợc sau điện di. ở điểm cân bằng, sẽ xuất hiện một cung kết tủa. Cung này dễ nhận thấy khi nhuộm màu protein.

Đây là một ph­ơng pháp phân tích rất hay dùng vì có khả năng phân chia cao. Nó có thể phân chia đ­ợc gần 30 protein huyết thanh nhờ một kháng huyết thanh cừu kháng protein huyết thanh ngư­ời. Những bất thư­ờng về số l­ợng và chất l­ợng protein huyết thanh của bệnh nhân có thể phát hiện dễ dàng bằng cách so sánh với một huyết thanh chứng bình thư­ờng đ­ợc đặt đối xứng qua máng và cùng chạy. Để đánh giá chính xác các bất th­ường, ng­ười ta dùng kháng thể monoclon đặc hiệu.