Qui trình nuôi cấy phân lập vi khuẩn Neisseria meningitidis

[tuyenlab]

3.2. Phương pháp xét nghiệm xác định não mô cầu từ bệnh phẩm

3.2.1. Phát hiện trực tiếp (Nhuộm soi trực tiếp): thường được áp dụng với dịch não tủy

Nguyên vật liệu và trang thiết bị:

+ Que cấy 1µl

+ Bộ nhuộm Gram

+ Lam kính và lamen

+ Đèn cồn

+ Kính hiển vi

+ Máy Vortex (máy trộn)

+ Máy ly tâm tốc độ từ 2000 – 15.000 vòng/ phút

Chuẩn bị tiêu bản:

*Nếu thể tích DNT > 1ml: ly tâm 2.000 vòng/20 phút hoặc 15.000 vòng/10 phút (trong trường hợp cần thực hiện phản ứng PCR).

- Dịch nổi: sử dụng trong phản ứng ngư­ng kết latex phát hiện kháng nguyên vỏ polysaccarit của não mô cầu (N. meningitidis).

- Cặn (sau ly tâm giữ lại 100 µl): sử dụng để nhuộm Gram và nuôi cấy hoặc cho các xét nghiệm khác (PCR...).

*Nếu thể tích DNT < 1ml: không cần ly tâm mà lấy 1-2 giọt nhuộm Gram (chú ý không phải dàn mỏng).

Tạo tiêu bản bệnh phẩm dịch não tủy (không cần dàn mỏng), nhuộm Gram quan sát bạch cầu đa nhân, hình thể vi khuẩn. Lưu ý, quan sát trực tiếp bệnh phẩm trước khi xử lý bệnh phẩm với hóa chất.

Nhuộm Gram:

Nhỏ lên lam kính sạch 1 giọt cặn, để khô tự nhiên, cố định trên ngọn đèn cồn (chú ý kiểm soát độ nóng của lam), nhuộm Gram theo hướng dẫn dưới đây. Quan sát dưới kính hiển vi nếu phát hiện thấy bạch cầu đa nhân trung tính và song cầu hình hạt cà phê bắt màu Gram âm nằm bên trong hoặc bên ngoài bạch cầu là dấu hiệu định hướng viêm màng não do não mô cầu.

Phương pháp nhuộm Gram

a/ Chuẩn bị thuốc nhuộm:

+ Thuốc nhuộm tím gentian:

Tím gentian, dung dịch bão hòa trong cồn 95[sup]o[/sup]: 10 ml

Axit phenic 1 ml

Nước cất 100 ml

Lắc đều lọc qua giấy.

+ Dung dịch lugol:

Iod 1 g

Kali Iodua 2 g

Nước 5 ml

Nghiền tan trong cối, rồi thêm nước cho đủ 200 ml

+ Thuốc nhuộm Fucsin kiềm:

Fucsin kiềm, dung dịch bão hòa trong cồn 95[sup]o[/sup]C: 10 ml

Axit phenic: 5 ml

Nước cất 100 ml

Lắc đều, lọc qua giấy.

b/ Cách nhuộm:

Dàn tiêu bản, để khô tự nhiên. Cố định tiêu bản trên phiến kính bằng cách hơ cao trên ngọn lửa đèn cồn, kiểm tra độ nóng (nhẹ vừa phải trên mu bàn tay). Chú ý: nóng quá, hoặc hơ lâu, vi khuẩn sẽ biến dạng.

Đổ thuốc nhuộm tím gentian lên tiêu bản, để 1 phút, rửa nước.

Đổ dung dịch lugol lên tiêu bản, để 1 phút, hất bỏ đi.

Tẩy màu bằng cồn 90[sup]o[/sup] hoặc hỗn hợp Acetone + cồn 90[sup]0[/sup] (tỷ lệ 1:1) tới khi bạc màu.

Rửa qua nước.

Đổ thuốc nhuộm Fucsin lên tiêu bản, để 1 phút.

Rửa qua nước.

Thấm giấy hoặc để khô ở không khí.

c/ Đọc kết quả:

Vi khuẩn Gram dương: màu tím (tím gentian).

Vi khuẩn Gram âm: màu đỏ (đỏ Fucsin).

Hình ảnh não mô cầu: song cầu hạt cà phê bắt màu hồng đậm

3.2.2. Nuôi cấy phân lập vi khuẩn não mô cầu (N. meningitidis)

Môi trường và sinh phẩm cho nuôi cấy phân lập:

+ Môi trường thạch máu chín (sôcôla) hoặc thạch máu cừu 5% (BD BBL Co.,).

+ Canh thang tăng sinh (Trypticase soy hoặc BHI có 5% Fildes enrichment - BD BBL Co., hoặc tương đương.

+ Oxidase (tetramethyl-p-phenylenediamine hydrochloride – BD BBL hoặc tương đương).

+ Bộ môi trường CTA (Cystine Trypticase Agar): CTA không đường và CTA có chứa 1 trong 4 loại đường Maltose, Glucose (hoặc Dextrose), Lactose và Sucrose (của BD BBL CO., hoặc tương đương).

+ Bộ kháng huyết thanh A, B, C, Y, W135 (Ref: 30859602 ZL26; Wellcogen Bacterial Antigen Kit- Remel, UK hoặc tương đương).

Dụng cụ và trang thiết bị cho nuôi cấy phân lập, định danh:

+ Que cấy có vòng ăng to (10µl) và nhỏ (1µl)

+ Các loại ống nghiệm thủy tinh và nhựa (bảo quản mẫu)

+ Pipet chính xác và các loại đầu tip 10µl, 100µl

+ Máy ly tâm tốc độ từ 2000 – 15.000 vòng/phút

+ Máy trộn Vortex

+ Kính hiển vi

+ Tủ ấm thường với bình kín đốt nến hoặc tủ ấm CO2

Hình 1: tiêu bản nhuộm dịch não tủy

(bạch cầu đa nhân và các song cầu hạt cà phê nằm bên trong tế bào bạch cầu)

Hình 2: vi khuẩn N. meningitidis xếp đôi (song cầu hình hạt đậu)

Nuôi cấy dịch não tủy:

Sau khi ly tâm DNT (2.000 vòng/20 phút hoặc 3.000 vòng/10 phút), giữ lại phần ‘cặn’(100 - 200µl) để ria cấy trên thạch sôcôla hoặc thạch máu 5% và cấy vào canh thang tăng sinh:

*Cấy 0,01ml DNT sau ly tâm vào môi trường đặc (thạch sôcôla và thạch máu 5%), lấy 0,05ml nữa cấy vào 1 ống môi trư­ờng tăng sinh (canh thang Trypticase soy hoặc canh thang não tim (BHI) có bổ sung 5% Fildes enrichment- Hãng Becton Dickinson hoặc 5% Levinthal Base (là canh thang BHI có 20% máu cừu được xử lý ở nhiệt độ 80[sup]0[/sup]C trong 20 phút, ly tâm lấy dịch nổi). Ủ qua đêm ở 37[sup]0[/sup]C/5% CO2 và độ ẩm ≥ 50%.

Sau 16-24h nuôi cấy, quan sát khuẩn lạc trên môi trường thạch, nếu trên môi trường thạch âm tính, phải cấy chuyển từ ống canh thang tăng sinh sang 1 đĩa thạch máu 5% mới và/hoặc 1 đĩa thạch sô cô la mới vào các ngày thứ 2, 3 và thứ 7. Sau 7 ngày âm tính ở canh thang tăng sinh mới kết luận bệnh phẩm âm tính với não mô cầu.

Nuôi cấy máu:

Trong trường hợp bệnh nhân đang sốt, lấy vô khuẩn 3ml - 5ml, cấy ngay theo tỷ lệ 1: 5 (máu/canh thang nếu của trẻ em) và 1:10 (nếu của người lớn) (cấy vào canh thang Trypticase soy [TSB] hay Brain Heart Infusion [BHI] có bổ xung chất hỗ trợ vi khuẩn phát triển như 5% Fildes enrichment hoặc 5% Levinthal Base - là canh thang BHI có 20% máu cừu được xử lý ở nhiệt độ 80[sup]0[/sup]C trong 20 phút, ly tâm lấy dịch nổi) hoặc vào canh thang cấy máu thương phẩm (Bio-Rad hoặc BioMérieux Co.,). Ủ ở 37[sup]0[/sup]C/5% CO2 và độ ẩm ≥ 50%. Theo dõi sau ≥ 20h, nếu có biểu hiện vi khuẩn phát triển (môi trường cấy máu đục, váng...), cấy chuyển tiếp sang môi trường thạch máu cừu 5% và/ hoặc thạch sô cô la, ủ tiếp ở ở 37[sup]0[/sup]C/5% CO2 và độ ẩm ≥ 50% qua đêm.

Quan sát khuẩn lạc nghi ngờ: trên thạch máu cừu 5% và thạch sôcôla. Khuẩn lạc tròn vồng nhẹ, bờ đều và có màu xám (đường kính khoảng 1mm), một số chủng vi khuẩn khi cấy dày trên thạch máu có thể có màu trắng kem. Khuẩn lạc não mô cầu không gây tan huyết môi trường và không có mùi. Các khuẩn lạc có xu hướng liên kết với nhau, khi đó hơi có ánh xanh. Khuẩn lạc tan dễ dàng trong nước muối sinh lý, tuy nhiên, sau 24 giờ nuôi cấy, khuẩn lạc trở nên dẻo dính là do não mô cầu tự ly giải, các chất nucleo-protêin đã thoát từ bên trong tế bào ra ngoài, lúc này nếu cấy chuyển thường thất bại vì phần lớn vi khuẩn đã chết.